文章信息
- 孙其松, 黄洁, 吴晓静, 江海东, 周琴
- SUN Qisong, HUANG Jie, WU Xiaojing, JIANG Haidong, ZHOU Qin
- 不同酸度酸雨对小麦花后氮硫代谢和籽粒蛋白组分的影响
- Effect of different acidities of acid rain on nitrogen and sulfur metabolism and grain protein levels in wheat after anthesis
- 生态学报, 2016, 36(1): 190-199
- Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(1): 190-199
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201408261692
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文章历史
- 收稿日期: 2014-08-26
- 修订日期: 2015-05-22
由于经济的快速发展,酸雨污染已成为中国重要的环境问题[1]。2012年《中国环境状况公报》显示,全国各酸雨监测点中,出现酸雨的市(县)占46.1%,酸雨频率在75%以上的地区占12.0%[2],可见中国的酸雨污染程度比较严重,尤其是在经济快速发展地区如长江流域[3]。前人研究表明酸雨会伤害植物叶片,降低叶绿素含量,抑制作物的光合作用及物质合成[4, 5, 6]。但同时也有研究显示酸雨对植物生长或某些代谢过程有一定促进作用,梁晓琴[7]研究显示,pH2.5酸雨处理的蒙古栎幼苗的生物量、株高、叶片数较对照显著增加。郑有飞[8]研究结果显示中低强度酸雨处理下,油菜的株高、叶面积和籽粒产量增加,其原因是因为酸雨的硫素供给对植株叶片面积有促进作用,从而增加了光合作用面积,促进了油菜籽生产。酸雨是由大气中SO2和NOx水解后行形成[9],来自于化石燃料燃烧和汽车尾气产生的SO2和NOx,会通过复杂的光化学反应进一步形成H2SO4和HNO3[4, 9]。酸雨中含有一定的SO42-和NO3-,会产生一定的肥效。和对照相比,pH3.2的酸雨处理后糖枫叶片中氮和硫的浓度明显比对照高[10]。小麦是江苏省第二大农作物,开花期至成熟期是小麦对环境逆境敏感时期,而此期也是江苏地区酸雨发生的概率和强度较大的时期[11]。酸雨胁迫对作物氮素营养的影响有一定报道,但研究结果不尽一致,而酸雨对硫素营养影响研究则较少。深入研究酸雨对植物氮硫代谢和主要营养成分的影响,对于科学评价酸雨对小麦品质的影响以及制定相应对策具有重要意义。本研究以两个品种小麦为试验材料,在不同酸度酸雨水平下研究了花后喷施酸雨对小麦氮硫代谢和籽粒营养品质的影响,以期为小麦抗酸雨栽培和品种的选育提供参考依据和技术支持。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试小麦品种为汶农17和扬麦15。汶农17,强筋、偏冬性、中晚熟品种,由泰安市汶农种业有限责任公司培育;扬麦15,弱筋、春性、中熟小麦品种,由江苏里下河地区农科所培育。
1.2 试验设计盆栽试验于2012年11月至2013年6月在南京农业大学牌楼试验站进行,供试土壤为黄棕壤。土壤自然风干后装入高20cm,直径25cm的塑料花盆中,每盆装土8kg。每盆土施用尿素2.6 g,KH2PO4 1.4 g,K2SO4 3.5 g,播种前肥料和土壤充分混匀,氮肥基追比为6 ∶ 4,追肥于拔节期施用。每盆播种10粒,三叶期定苗,每盆留苗6株。酸雨参照卞雅娇的方法配制[12],以SO42-与NO3-摩尔比5 ∶ 1配成母液,加入CaC12、NH4Cl等药品,使各自浓度为CaC12 3.1 g/L,NH4Cl 2.8 g/L,NaCl 0.91 g/L和KCl 0.75 g/L,稀释母液1000倍并调节pH值。试验共设3个酸雨处理:对照(pH5.6)、pH4.0酸雨和pH2.5酸雨。开花期进行酸雨处理,每5d喷施1次直至成熟,每次酸雨的喷施量相当于5mm降雨量。试验为随机区组设计,3次重复,管理措施同大田高产栽培。
开花期选择同一天开花且生长一致麦穗挂牌标记。分别于开花后0、5、10、15、25和30 d取旗叶,花后 10、15、20、25、30 d和 35 d 取麦穗,用液氮固定后-40℃保存,旗叶去除基部和叶尖,留中间部分,穗子剥取从基部数起第5—12个小穗的第1、2位籽粒,用于各项生理指标的测定。同时取干样,分器官后于105℃杀青30min后,70℃烘至恒重,干燥贮藏备用。
1.3 测定项目与方法游离氨基酸含量测定采用茚三酮比色法[13],可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[13]。硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定参照现代植物生理学实验指南[14]。小麦籽粒中各氨基酸组分含量用氨基酸自动分析仪(GB 7649—87)测定,蛋白质含量测定采用半微量凯氏定氮法[14],以全氮量乘以5.7即为籽粒蛋白质含量,蛋白质组分采用连续提取法[15]。
丝氨酸乙酰转移酶和O-乙酰丝氨酸硫裂解酶活性测定参照Hartmann方法测定[16],具体步骤如下:称取旗叶叶片鲜重1.0g左右置于预先冷冻过的研钵中,加入少量预冷的经酸洗过的石英砂和3mL提取液(30mmol/LTris-HCl,内含10 mmol/L的 DTT),冰浴下研磨至匀浆,倒入离心管,4℃下14000r/min离心20 min。
O-乙酰丝氨酸硫裂解酶活性测定:取上清液0.1 mL,加入0.1 mL 反应液(50 mmol/L的K2HPO4-KH2PO4(pH7.5),5 mmol/L DTT,10 mmol/L O-乙酰丝氨酸,2 mmol/L Na2S)。25℃条件下培养10min,50μL 20%(重量体积比)TCA(三氯乙酸)终止反应,4℃下14000r/min离心20min,蛋白质被沉淀出来。上清液转移到试管中,加入100μL浓缩的醋酸和200μL水合茚三酮试剂(250mg水合茚三酮溶解在10 mL的浓缩醋酸与浓盐酸(体积比6 ∶ 4)中。试管放在煮沸水中煮沸10min,加入550μL 95%(体积比)乙醇,然后迅速冷却。以半胱氨酸做标准曲线,560nm下测吸光度,然后计算O-乙酰丝氨酸硫裂解酶的活性。
丝氨酸乙酰转移酶活性测定:取上清液 0.1mL,加入0.1mL 反应液(4 mmol/L丝氨酸,2 mmol/L乙酰辅酶A,50 mmol/L的K2HPO4-KH2PO4(PH7.5),0.5 mmol/LDTT 和1 mmol/L Na2S)。25℃条件下培养30min,50μL 20% (w/v)TCA(三氯乙酸)终止反应,4℃下14000r/min离心20min,蛋白质被沉淀出来。上清液转移到试管中,加入100μL浓缩的醋酸和200μL水合茚三酮试剂(250mg水合茚三酮溶解10 mL的浓缩醋酸与浓盐酸(体积比6 ∶ 4)中。试管放在煮沸水中煮沸10min,加入550μL 95%乙醇,然后迅速冷却。以半胱氨酸做标准曲线,560nm下测吸光度,然后计算丝氨酸乙酰转移酶的活性。
二硫键、硫氢键含量测定采用Ellman′S试剂比色法测定[17]。具体步骤如下:称取100 mg面粉,用1 mL Tris-Gly缓冲液溶解混匀后加入4.7 g盐酸胍,并用此缓冲液定容至10mL。
—SH含量测定:取该溶液1 mL,加4 mL脲-盐酸胍溶液和0.05 mL Ellman′S试剂,于412 nm处比色(以不含蛋白的Tris-Gly 缓冲液作对照)。
—S—S—的测定:取该溶液1 mL,加0.05 mL巯基乙醇和4 mL脲-盐酸胍溶液,25℃保温1h,加10mL 12%TCA,继续25℃保温1h,4000r/min离心10 min,用5 mL 12%TCA清洗沉淀物两次,将沉淀物溶于10 mL 10 mol/L脲溶液中,加0.05 mL Ellman′S试剂,412 nm处比色测总—SH含量。
—SH含量计算公式:
—S—S—含量的计算方法:
采用Excel 2007软件处理试验数据,并用SPSS18.0软件对试验数据进行两因素的方差分析,处理间均值的多重比较用Duncan 新复极差法,试验结果是3次重复的平均值。
2 结果与分析 2.1 酸雨对小麦氮代谢过程的影响 2.1.1 酸雨对小麦叶片游离氨基酸含量的影响两个品种小麦叶片游离氨基酸含量总体均呈现先上升再下降的趋势,在花后10d达到最大值,随后均迅速降低(图 1)。灌浆初期酸雨显著提高了汶农17叶片中游离氨基酸含量,随后低于对照,花后30d后,下降幅度小于对照。扬麦15在整个灌浆期酸雨处理游离氨基酸含量高于对照,酸度越高游离氨基酸含量越高。
2.1.2 酸雨对小麦叶片可溶性蛋白含量的影响两个品种小麦叶片可溶性蛋白含量随着灌浆进程的推进不断下降,酸雨降低了可溶性蛋白质含量,随酸雨酸度增强可溶性蛋白质含量下降幅度增大(图 2)。pH2.5酸雨处理后,汶农17中可溶性蛋白含量自花后10d起分别较对照降低了26.58%、28.37%、42.08%、55.94%和63.59%,均与对照差异显著;扬麦15中可溶性蛋白含量自花后10d起分别较对照下降了21.31%、11.14%、22.94%、39.64%和30.99%(P<0.05)。
2.1.3 酸雨对小麦叶片硝酸还原酶(NR)活性的影响开花后两个品种小麦叶片NR活性不断下降,酸雨降低了NR活性(图 3)。pH2.5酸雨处理后,两个品种小麦NR活性下降明显,汶农17酶活性下降的幅度远大于扬麦15,花后10d汶农17和扬麦15 NR活性分别比对照低30.28%和23.69%。灌浆末期两个品种小麦NR活性受酸雨影响相对较小。
2.1.4 酸雨对小麦叶片谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响两个品种小麦叶片GS活性呈先缓慢上升后快速上升趋势,峰值出现在花后25d,随后酶活性迅速下降(图 4)。酸雨对GS活性影响因品种而异,花后0—15d时酸雨提高了扬麦15 GS活性,pH2.5酸雨处理降低了汶农17 GS活性。花后20d后,酸雨处理提高了两品种GS活性,均与对照差异显著,花后25d时pH4.0和pH2.5酸雨处理使汶农17 GS活性分别提高了7.32%和14.48%,扬麦15 GS活性分别提高了8.44%和20.05%。
2.2 酸雨对小麦硫素代谢的影响 2.2.1 酸雨对小麦叶片丝氨酸乙酰转移酶(SAT)活性的影响两个品种小麦叶片SAT活性均随着灌浆进程的推进,呈先上升后降低趋势,花后25d酶活性达到峰值(图 5)。酸雨对SAT活性的影响因品种而异,整个灌浆期,酸雨对汶农17 SAT活性影响较小。花后15d后,酸雨显著提高了扬麦15 SAT活性。花后15、20、25、30d时pH4.0酸雨处理与对照相比SAT活性分别提高43.94%、31.69%、22.34%、17.44%,pH2.5酸雨处理与对照相比SAT活性分别提高83.96%、58.47%、26.23%、19.06%,表明随着酸雨酸度提高,扬麦15 SAT活性升高。
2.2.2 酸雨对小麦叶片O-乙酰丝氨酸硫裂解酶(OAS-TL)活性的影响汶农17 OAS-TL活性变化趋势与SAT活性变化类似,不同酸雨处理间差异不显著(图 6),表明酸雨对汶农17叶片 OAS-TL的影响较小。酸雨提高了扬麦15叶片 OAS-TL活性,且随着酸度的增加酶活性升高,pH4.0酸雨处理酶活性与对照相比差异基本不显著。花后15—20d,pH2.5酸雨处理酶活性显著高于其它两个处理。
2.3 酸雨对小麦籽粒蛋白质及氨基酸含量的影响 2.3.1 酸雨对小麦籽粒总游离氨基酸含量的影响小麦籽粒游离氨基酸含量随着灌浆进程推进不断下降(图 7)。灌浆前期pH2.5酸雨处理降低了籽粒氨基酸含量,花后10d时,汶农17和扬麦15 pH2.5酸雨处理游离氨基酸含量分别比对照低24.92%和17.44%(P<0.05)。灌浆中后期对照游离氨基酸含量下降速度高于酸雨处理。花后35d,汶农17 pH4.0和pH2.5酸雨处理游离氨基酸含量与对照相比分别高66.61%和134.28%,扬麦15 pH4.0和pH2.5酸雨处理游离氨基酸含量与对照相比分别高25.4%和47.01%。
2.3.2 酸雨对小麦籽粒蛋白质含量及其组分的影响从表 1中可以看出,酸雨能显著降低两个品种小麦籽粒产量,pH4.0、pH2.5酸雨处理使汶农17籽粒产量较对照依次下降了3.48%、13.73%,扬麦15籽粒产量依次下降了2.17%、8.16%。说明两个品种小麦籽粒产量随酸度升高而降低,酸雨对汶农17籽粒产量影响更大。酸雨显著提高了两个品种小麦籽粒蛋白质含量,但对蛋白质产量影响因品种而异,酸雨显著升高了扬麦15蛋白质产量,pH2.5酸雨处理降低汶农17蛋白质产量。酸雨提高了清蛋白、球蛋白含量、醇溶蛋白、谷蛋白含量,且随着pH值的降低,4种蛋白组分升高的幅度增大。
品种 Cultivar | 处理 Treatment | 产量 Yield / (g/株) | 蛋白质产量 Protein yield / (g/株) | 总蛋白质 Protein/% | 清蛋白 Albumin/% | 球蛋白 Globulin/% | 醇溶蛋白 Gliadin/% | 谷蛋白 Glutenin/% |
pH5.6 | 2.26c | 0.30c | 13.26c | 2.38b | 1.02c | 4.68c | 3.03c | |
汶农17 | pH4.0 | 2.18d | 0.31c | 13.91b | 2.53b | 1.34a | 4.85b | 3.44b |
PH2.5 | 1.95e | 0.28d | 14.48a | 2.85a | 1.37a | 5.02a | 3.74a | |
pH5.6 | 3.05a | 0.35b | 12.50d | 1.92c | 0.88d | 3.52e | 2.83d | |
扬麦15 | pH4.0 | 2.99a | 0.40a | 13.32c | 2.23b | 1.05c | 3.67e | 3.05c |
pH2.5 | 2.80b | 0.39a | 13.98b | 2.44b | 1.22b | 3.90d | 3.66a | |
表中数值为平均值(n=3),相同字母表示差异不显著,小写字母表示P﹤0.05 |
小麦籽粒含硫氨基酸主要是半胱氨酸和甲硫氨酸,从表 2中可以看出,酸雨显著提高了扬麦15含硫氨基酸含量,酸度越高含硫氨基酸含量越高,汶农17不同处理间含硫氨基酸含量差异不显著。两个品种小麦籽粒中的硫氢键和二硫键含量随着酸雨酸度升高而上升,pH4.0和pH2.5酸雨处理使汶农17硫氢键含量与对照相比增加了5.97%和7.93%,扬麦15增加了4.84%和7.63%。pH4.0和pH2.5酸雨处理使汶农17二硫键含量比对照增加了3.47%和6.16%,扬麦15增加了2.93%和4.61%。表明和扬麦15相比,酸雨更能提高汶农17硫氢键和二硫键含量。
品种 Cultivar | 处理 Treatment | 半胱氨酸含量 Cys/% | 甲硫氨酸 Met/% | 硫氢键 —SH/(μmol/g) | 二硫键 —S—S—/(μmol/g) |
汶农17 | pH5.6 | 0.254a | 0.203ab | 3.532d | 7.367d |
pH4.0 | 0.253a | 0.213a | 3.743c | 7.623c | |
PH2.5 | 0.258a | 0.203ab | 3.812c | 7.821b | |
扬麦15 | pH5.6 | 0.221c | 0.165d | 3.969b | 7.878b |
pH4.0 | 0.239b | 0.176c | 4.161ab | 8.109a | |
pH2.5 | 0.265a | 0.193b | 4.272a | 8.241a | |
表中数值为平均值(n=3),相同字母表示差异不显著,小写字母表示P﹤0.05 |
从表 3中可以看出,酸雨对小麦籽粒中组成蛋白质其余氨基酸含量有较大影响。在pH4.0和pH2.5酸雨处理下,汶农17籽粒组成蛋白质其余氨基酸含量较对照依次增加了4.83%和8.57%,扬麦15较对照依次增加了14.52%和22.14%,说明酸雨使扬麦15组成蛋白质其余氨基酸含量增加的幅度大于汶农17,且籽粒中组成蛋白质其余氨基酸含量随着酸度升高而升高。
氨基酸组分 Amino acid composition | 汶农17 | 扬麦15 | ||||
pH5.6 | pH4.0 | pH2.5 | pH5.6 | pH4.0 | pH2.5 | |
天冬氨酸Asp | 0.650 | 0.676 | 0.706 | 0.565 | 0.618 | 0.640 |
丝氨酸Ser | 0.637 | 0.672 | 0.696 | 0.585 | 0.667 | 0.701 |
谷氨酸Glu | 4.281 | 4.555 | 4.728 | 3.824 | 4.540 | 4.829 |
甘氨酸Gly | 0.558 | 0.572 | 0.597 | 0.507 | 0.569 | 0.605 |
组氨酸His | 0.326 | 0.335 | 0.351 | 0.269 | 0.305 | 0.328 |
精氨酸Arg | 0.614 | 0.628 | 0.644 | 0.525 | 0.570 | 0.624 |
脯氨酸Pro | 1.295 | 1.356 | 1.420 | 1.099 | 1.304 | 1.427 |
酪氨酸Tyr | 0.371 | 0.391 | 0.349 | 0.343 | 0.345 | 0.388 |
丙氨酸Ala | 0.496 | 0.511 | 0.544 | 0.425 | 0.465 | 0.483 |
苏氨酸Thr | 0.397 | 0.415 | 0.427 | 0.357 | 0.398 | 0.415 |
缬氨酸Val | 0.596 | 0.617 | 0.640 | 0.517 | 0.576 | 0.607 |
异亮氨酸Ile | 0.441 | 0.461 | 0.480 | 0.386 | 0.439 | 0.471 |
亮氨酸Leu | 0.936 | 0.972 | 1.006 | 0.797 | 0.905 | 0.964 |
苯丙氨酸Phe | 0.629 | 0.657 | 0.680 | 0.550 | 0.633 | 0.683 |
赖氨酸Lys | 0.389 | 0.407 | 0.429 | 0.351 | 0.378 | 0.392 |
总计Total/% | 12.616 | 13.225 | 13.697 | 11.1 | 12.712 | 13.557 |
苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸是必需氨基酸,酸雨提高两个品种小麦必需氨基酸含量,说明酸雨一定程度上可以提高小麦的营养品质。
3 讨论酸雨改变了植物生长的环境,打破了其内部的酸碱平衡,造成植物形态和生理机能的损伤[8],引起植株生物量或产量的下降。本研究结果显示在酸雨胁迫下,小麦产量呈下降趋势,尤其是pH2.5酸雨处理产量显著下降,与前人研究结论一致[5, 12]。不同品种对酸雨响应程度不同,本研究中酸雨对汶农17产量影响大于扬麦15。
酸雨对植物除了具有酸度胁迫效应,也具有氮、硫元素的营养效应,在一定程度上影响植物的氮硫代谢。酸雨对植物氮代谢影响比较复杂,有研究显示,酸雨处理抑制了杜仲硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)等氮代谢关键酶活性[18, 19],降低了小麦叶片氨基酸、可溶性蛋白含量[5]和叶片的含氮量[6, 19]。但也有研究显示酸雨对氮的累积没有影响[18]或能提高了小麦根系和地上部的含N量[20]及小麦籽粒蛋白质含量[12]。本研究结果显示强酸雨(pH2.5)处理降低了小麦叶片NR活性和可溶性蛋白含量,表明酸雨可能抑制了叶片蛋白的合成,与前人研究结果基本一致[21]。叶片可溶性蛋白含量的下降也有可能由于酸胁迫下蛋白质的水解加剧所致。本研究结果显示酸雨处理提高了扬麦15整个灌浆期和汶农17灌浆中后期旗叶GS活性。GS是一种多功能酶,它与氮高效利用、作物耐逆特性密切相关[22]。GS活性提高可促进叶片蛋白降解形成谷氨酰胺,进而运输到籽粒为蛋白质合成提供底物,这也可能是酸雨处理后叶片游离氨基酸含量不同程度升高及籽粒蛋白质含量升高的原因。
我国酸雨以硫酸型为主,SO42-是酸雨中最主要的阴离子,喷施酸雨在一定程度上增强了对植株的硫营养供应。本研究结果显示酸雨处理提高了两个品种小麦籽粒中含硫氨基酸和二硫键的含量。植物吸收的SO42-经过植物一系列还原与同化反应后进入有机骨架,生成半胱氨酸(Cys),植物以Cys为前体,再合成众多具有重要生物学功能的代谢产物,其中SAT和OAS-TL是Cys合成的关键酶[23]。本研究结果显示酸雨处理明显提高了扬麦15硫代谢关键酶活性,但对汶农17硫代谢关键酶活性影响很小,表明酸雨提高了扬麦15硫素同化能力,这也可能是扬麦15对酸雨抗性较汶农17强及籽粒含硫氨基酸含量变化大于汶农17的原因。
蛋白质是小麦籽粒的重要成分,清蛋白、球蛋白及必需氨基酸的含量影响营养品质,而谷蛋白和醇溶蛋白决定面团的黏弹性,对面粉加工品质产生重要影响[24]。本研究结果显示随着酸雨酸度增大,籽粒中总蛋白及各蛋白组分含量逐渐升高。这可能是由于酸度越强,酸雨中的NO3-、SO42-越多,起到了增施氮、硫肥的效果[25]。氮和硫均是蛋白质分子不可缺少的组成部分,充足的硫含量提高了含硫氨基酸含量,有利于富含Cys和Met的蛋白质的合成[26],含硫蛋白Cys 中的二硫键(—S—S—)有助于提高面筋的弹力,进而影响小麦的加工品质。可见酸雨提高了两品种籽粒氨基酸组分及蛋白组分含量,可能有助于强筋小麦汶农17加工品质的改善,但不利于弱筋小麦扬麦15加工品质的改善。小麦籽粒蛋白质和氨基酸组分含量的提高也可能和籽粒产量下降形成的浓缩效应有关。
综上所述,花后不同酸度酸雨降低了小麦籽粒产量,对小麦氮硫代谢也产生了一定影响。酸雨处理抑制了叶片NR活性,在灌浆中后期提高了叶片GS活性,促进氮素的分解转移,为籽粒蛋白质合成提供底物,总体提高了籽粒氨基酸组分、籽粒蛋白质含量及组分的含量、含硫氨基酸和二硫键的含量,有利于两品种小麦的营养品质提高,但对两品种小麦加工品质有不同影响。
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