褐云玛瑙蜗牛(Achatina fulica Bowditch)又称非洲大蜗牛,隶属玛瑙螺科(Achatinidae)玛瑙螺属(Achatina),原产东非沿岸桑给巴尔、奔巴岛一带,现已知分布全世界,在我国仅此一种,主要分布在我国广东、广西、云南南部等地区^[1]。据Jarrett报道,褐云玛瑙蜗牛于1930年开始在中国传播,随后在中国北回归线以南地区大肆繁殖和扩散。褐云玛瑙蜗牛啃食十字花科蔬菜、茶叶、花卉和甘蔗的枝叶,以及木瓜、芭蕉芋、红薯、香蕉和柑橘等果实^{[2, 3, 4]},它是农林业、园艺业的间隙性害虫,破坏园林的景观,破坏生物多样性,影响遗传多样性。据报道，2013年9月，中国南宁市郊出现巨型褐云玛瑙蜗牛疯狂繁殖并对农田造成很大危害；同年4月，美国佛罗里达州成千上万的“非洲巨蜗牛”入侵。在菲律宾、印度和巴基斯坦等国家的入侵地也有蜗牛对农作物危害的相关报道^{[5, 6]}。目前,在农林业生产中,主要采用化学药剂防治,虽然防控效果较好,但化学农药的残留,对农林业生态环境及农产品带来明显的负面影响,在一定程度上降低了自然生态系统的生物多样性和破坏生态平衡^{[7, 8]}。薇甘菊(Mikania micrantha)、南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)、五爪金龙(Ipomoea cairica)及马缨丹(Lantana camara)等植物原产于中南美洲,是粤东地区分布广泛、生长迅速及危害严重的入侵植物种类^{[9, 10]},对粤东地区生态环境造成严重的破坏和影响^{[11, 12]}。入侵植物种类丰富,生长旺盛,取材方便,植物体内含有挥发油、酯类及萜烯类等多种有机化学成分,利用其有效成分可以对农林害虫进行调控,达到以害制害,化害为利的防控作用^{[13, 14, 15, 16, 17, 18]}。本研究利用4种入侵植物水提取液对褐云玛瑙蜗牛生存、发育和繁殖进行调控试验,分析不同入侵植物水提取液对蜗牛触杀效果及对其卵发育抑制的差异性,为生产实践中有效控制褐云玛瑙大蜗牛对农林业的危害,为开发植物源农药提供可靠的科学依据，为保护农林业生态环境和生物多样性提供科学理论参考,旨在探索对褐云玛瑙蜗牛防控的新途径^{[19, 20, 21, 22]}。

褐云玛瑙蜗牛(Achatina fulica Bowditch),五爪金龙(Ipomoea cairica),马缨丹(Lantana camara),南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata),薇甘菊(Mikania micrantha)。

褐云玛瑙蜗牛的采集：2011年7—8月份,在潮州滨江长廊、慧如公园和校园草坪中采集褐云玛瑙蜗牛,并调查不同生境状况(表 1)。测定不同生境土壤有机碳(采用重铬酸钾氧化—分光光度法测定)测定土壤pH值(采用电位法测定)。筛选健康褐云玛瑙蜗牛,并用白菜、生菜、黄瓜等蔬果饲养于阴凉处,根据调查结果(表 1),提供适宜蜗牛生长和繁殖条件：控制养殖箱温度为25—35 ℃,湿度60%—85%；土壤湿度在40%左右,pH值为5—7。在上述条件下养殖蜗牛并使其繁殖产卵,以备挑选成体、幼体褐云玛瑙蜗牛及卵供实验之用^[23]。

入侵植物的采集地点：在惠如公园、东丽湖边采集南美蟛蜞菊；在校园周边山脚下、慧如公园路边和灌木丛中采集五爪金龙和马樱丹；在林间灌木丛中采集薇甘菊(表 1)。

入侵植物采集时间：在秋季(9月份)，选择成熟期的4种入侵植物，采集其地上枝干(叶)部分,充分晒干后,剪成长2 cm以内的小段并粉碎备用。

用天平准确称取粉碎好的五爪金龙粉末400 g,放置于2000 mL烧杯中,加2000 mL蒸馏水中浸泡15 h。将入侵植物浸泡液2000 mL煎煮1.5 h,过滤,并将滤液煎煮浓缩成400 mL,即得到浓度为1.0g/mL的五爪金龙水提取液。依上述方法,同样可得到浓度为1.0 g/mL的马缨丹、南美蟛蜞菊和薇甘菊水提取液,依据同样方法,制备4种入侵植物不同浓度的水提取液^{[24, 25]}。

对蜗牛喷施各处理组入侵植物提取液,每隔6 h检查蜗牛生命体征,把腹足深陷到体螺层内,并分泌大量粘液的褐云玛瑙蜗牛取出,放入另一容器中,喷清水1次/2 h,并保持湿度在 60%—80%之间,如在6 h后仍无生命活动特征,即可判断其死亡^[25]。

筛选6—7个螺层、活动正常、健康的成体褐云玛瑙蜗牛(螺重(250±10) g) 360只,随机分成6组,每组60只,分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ,然后将其置于直径80cm的塑料盆中,保持湿度60%—80%,温度25—35 ℃。I为空白对照组,喷雾状清水做空白对照实验；Ⅱ为实验对照组,喷10%四聚乙醛 (以6%密达颗粒剂配制))药剂溶液；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ分别喷浓度为马缨丹、五爪金龙、南美蟛蜞菊和薇甘菊试验组,分别喷浓度为1.0 g/mL各入侵植物水提取液；空白对照组喷清水200 mL,实验组各取200 mL水提取液,分别装在500 mL喷壶里,每隔6 h喷雾状提取液一次,每次喷2 mL,30 min 后观察,分别记录24、48、72、96、120、142 h的活动情况及死亡数量^[14]。

蜗牛的活动状况可记录为：伸展(头、腹足伸出体螺层,可见足与触角活动)、缩回(腹足缩回体螺层螺口内,但可见,不伸展；头与触角不可见)、深陷(足与头深陷体螺层内,腹足与头均不可见)3种情况。

筛选3—4个螺层、活动正常、健康的幼体褐云玛瑙蜗牛(螺重(50±10) g)360只,采取同样方法,观察和记录1.0 g/mL 4种入侵植物提取液对幼体褐云玛瑙蜗牛的毒杀效果,每个处理3次重复。

收集同期产出、正常无损伤的蜗牛卵600个,随机平均分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ 5组。每组120个卵,分别置于盛有5—6 cm厚的土壤的大塑料盆中,并稍微覆盖少许细砂,再加盖一层湿纱布保湿,控制温度为25—35 ℃,湿度60%—85%。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为1.0 g/mL马樱丹、五爪金龙、南美蟛蜞菊和薇甘菊4种入侵植物水提取液试验组,V为对照组,喷洒清水。每6 h喷1次,每次2 mL,每天统计1次出壳数，每个处理3次重复。出壳率的计算公式为：卵的出壳只数/卵的总数。

筛选6—7个螺层、活动正常的健康成体褐云玛瑙蜗牛(螺重(250±5) g)360只,随机分成5组,每组60只,分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ和Ⅳ,将其置于直径为80 cm的塑料盆中,保持湿度为60%—80%,温度25—35 ℃。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 分别喷1.0、1.5、2.0 g/mL的薇甘菊水提取液,IV喷10% 四聚乙醛溶液。每6 h喷1次,每次2 mL,30 min 后观察,并分别记录24、48、72、96、120 h和142 h的活动情况及死亡数量,每个处理3次重复。

筛选成体蜗牛240只,每组60只,实验条件同上,每隔6 h喷洒1.0 g/mL 4种不同入侵植物水提取液,记录毒杀蜗牛的死亡个数；幼螺处理组设计方案与实验方法同成体蜗牛,每个处理3次重复。

采用统计软件SPSS 16.0中的One-way ANOVA (Duncan) 对实验结果进行组间差异性比较。

以1.0 g/mL马缨丹、五爪金龙、南美蟛蜞菊、微甘菊入侵植物水提取液及10%四聚乙醛溶液处理褐云玛瑙蜗牛,分别在72、24、24、60 h和60 h开始出现死亡,清水对照处理组在120 h内成活率为100%,无蜗牛死亡。以1.0 g/mL薇甘菊和南美蟛蜞菊水提取液对蜗牛喷杀处理,薇甘菊处理组致蜗牛出现死亡的时间为60 h，较为缓慢，南美蟛蜞菊处理组致蜗牛出现死亡的时间为24 h，较快,二者对蜗牛触杀的有效时间 (蜗牛开始死亡至全部死亡历经的时间) 分别为82 h和118 h；与前者相比,马缨丹处理组蜗牛开始出现死亡的时间最慢,为72 h^[15]。在84—120 h之间,4种入侵植物水提取液均进入杀螺高峰期,并且在84 h—108 h期间,各处理组的触杀效果存在显著性差异(P<0.05)。10%四聚乙醛溶液杀螺效果在60 h后呈快速增加趋势,而入侵植物水提取液对蜗牛触杀效果呈缓慢增加趋势。综述实验结果表明,1.0 g/mL薇甘菊和南美蟛蜞菊水提取液对蜗牛的触杀效果相近,在处理132 h后,薇甘菊和南美蟛蜞菊水提取液对蜗牛的触杀率相继达到100%；在处理142 h后，1.0 g/mL五爪金龙和马缨丹水提取液对蜗牛的触杀率分别达到58.67%和 33.33%，马缨丹触杀效果最差(表 2)。4种入侵植物水提取液对成体褐云玛瑙蜗牛触杀效果强弱顺序为：薇甘菊＞南美蟛蜞菊＞五爪金龙＞马缨丹。

各处理组喷杀幼体蜗牛18 h后,1.0 g/mL无爪金龙和南美蟛蜞菊水提取液首先表现杀螺效果,24 h后4种入侵植物水提取液均对发育期蜗牛产生强烈的触杀作用。在24—48 h内,薇甘菊水提取液杀螺效果与其它3个处理组间表现显著性差异(P<0.05)；除1.0 g/mL马樱丹外,其他3个处理组对幼体蜗牛的触杀效果与成体蜗牛处理组相比,杀螺的有效时间缩短2倍以上。1.0 g/mL马缨丹水提取液对幼体褐云玛瑙蜗牛的触杀效果也有很大提高(表 3)。幼体蜗牛尚未发育完全,抗药性低,入侵植物水提取液对其有效触杀时间明显缩短^{[19, 20, 21, 22]}。

以1.0 g/mL 4种入侵植物水提取液处理蜗牛卵,随着处理时间的延长,各处理组累积出壳数也随之增多。处理第2天,4种入侵植物水提取液对蜗牛卵发育的抑制作用呈剧增趋势,随后呈现平稳增加趋势。处理4d开始,薇甘菊对蜗牛卵的抑制效果与其它处理组间出现显著差异(P<0.05)。处理第8天,空白对照组蜗牛卵累积出壳率为72.78%,五爪金龙处理组蜗牛卵累积出壳率为 43.06%,卵发育抑制率只有56.94%，南美蟛蜞菊处理组蜗牛卵累积出壳率为25%，卵发育抑制率达75%，薇甘菊处理组蜗牛卵累积出壳率只有18.33%(表 4)，卵发育抑制率高达81.67%。从实验结果来看,1.0 g/mL马樱丹提取液对蜗牛卵的抑制效果优于五爪金龙提取液,其原因可能是马樱丹含有的马缨丹烯A(Lantadene A)及其化学组分对蜗牛卵产生了强烈的毒性效应,抑制了卵细胞的生物活性,降低了卵的出壳率。4种入侵植物水提取液抑制蜗牛卵发育效果强弱顺序为：薇甘菊>南美蟛蜞菊>马缨丹>五爪金龙。

以1.0、1.5、2.0 g/mL的薇甘菊处理组及10%四聚乙醛实验组处理成体蜗牛,1.0 g/mL 薇甘菊提取液处理组在42 h后,蜗牛开始出现死亡；而其它处理组在24 h后,蜗牛都开始出现死亡,并且在42 h后出现强烈触杀作用,蜗牛死亡数大量增加。处理78 h后,2.0 g/mL薇甘菊处理组和10%四聚乙醛处理组触杀率均达100%,1.5 g/mL薇甘菊处理组在96 h时触杀率达100%,而1.0 g/mL薇甘菊处理组在132 h时才达到100%的触杀率 (图 1)。由此看出,1.5、2.0 g/mL的薇甘菊水提取液对褐云玛瑙蜗牛的触杀作用发生时间较快,并由于薇甘菊水提取液的有效化学成分在蜗牛内的累积作用,对蜗牛触杀有效时间较长,产生了显著的触杀效果。

图 1 不同浓度薇甘菊对成体褐云玛瑙蜗牛的触杀效果 Fig.1 The contact-killing effects of water extracts of Mikania micrantha on the adult Achatina fulica

图选项

从图 2中看出,在触杀有效时间内,各处理组对幼体和成体蜗牛触杀的个体数量变化特征有明显差异,幼体蜗牛个体死亡数量呈急剧增加趋势,而成体蜗牛个体死亡数量呈相对平缓的增加趋势。以1.0 g/mL五爪金龙处理组喷杀幼体蜗牛,18 h后蜗牛开始出现死亡,触杀有效时间快于其他处理组；1.0 g/mL五爪金龙、1.0 g/mL南美蟛蜞菊和1.0 g/mL薇甘菊水提取液处理幼体蜗牛全部至死的时间与成体蜗牛处理组相比,所需时间分别缩短了 60、60、48 h。1.0 g/mL马缨丹处理组在120 h 内对成体褐云玛瑙蜗牛的杀螺效果只有50.55%,而对幼体的毒杀率可达100%(图 2)。4种入侵植物水提取液对幼体蜗牛的杀螺效果均显著于成体蜗牛的杀螺效果,1.0 g/mL薇甘菊水提取液与1.0 g/mL五爪金龙水提取液的杀螺效果相当,均高于其他两种处理组的杀螺效果。

图 2 1g/mL 4种植物提取液对褐云玛瑙蜗牛幼体和成体触杀效果比较 Fig.2 The toxic effects to the larvae and adults of A. fulica by the extract from 4 invasive plants with the concentration of 1g/mL

图选项

四聚乙醛是一种选择性很强的杀螺剂,主要成分为2,4,6,8-四甲基-1,3,5,7-四氧杂环辛烷,其毒杀机制是促使螺体内乙酰胆碱酯酶大量释放,破坏螺体内特殊的黏液,使螺体迅速脱水,麻痹神经,分泌黏液和体液流失,细胞被破坏,从而导致螺体死亡^[26]。入侵植物的水提取物杀螺是植物体内多种化学成分协同作用的结果^{[27, 28]}。4种入侵植物提取物中含有的活性成分不同,形成的组分复合物对蜗牛产生的毒性不同,因此,不同入侵植物水提取物对蜗牛的触杀效果存在显著差异。其中,薇甘菊、南美蟛蜞菊和五爪金龙水提液具有较好的杀螺效果,表明其提取物中含有的多组分复合物对蜗牛产生了较强的毒性,而马缨丹提取物毒性较小,对蜗牛的触杀效果较弱。幼体蜗牛尚未发育完全,抗药性低,入侵植物提取物对其有效毒杀时间大大缩短。胡飞等认为,植物体内多种活性成分协同作用产生的毒性可能是植物源杀螺剂与合成化学杀螺剂的本质差异^[27]。入侵植物水提取液对蜗牛卵发育的抑制可能与提取物中多组分复合物阻断了细胞膜信号转导相关,或者破坏相关酶的活性,而导致RNA转录、DNA复制或蛋白质合成的某一环节受阻所致^{[14, 15, 29]}。但这种推论需要对植物体内的多组分复合物协同作用机制和毒理进一步研究后证实。入侵植物水提取液对褐云玛瑙蜗牛成体、幼体的触杀率及对其卵发育的抑制效果,表明不同入侵植物对蜗牛的防控机制上存在差异。

野外调查显示,褐云玛瑙蜗牛主要栖息在园林绿化草地,柑橘园和茶园也常见,由于该地区菜地面积小,人工管理等干扰,菜地中偶见单螺层的幼体蜗牛。在南美蟛蜞菊入侵地偶见蜗牛栖息,在其它3种植物的入侵地或枝叶上未发现褐云玛瑙蜗牛栖息,这说明褐云玛瑙蜗牛对4种入侵植物具有一定忌避或拒食作用^{[14, 15, 25, 28]}。入侵植物在粤东地区分布广泛,生长旺盛,资源丰富,取材方便,在化学防除措施不成熟的情况下,通过刈割,可以有效地控制入侵植物的繁殖和生长,减少其对入侵地生态系统的破坏,从而保护生态环境。入侵植物水提取物制备方法简单,操作容易,成本低廉,亦可通过浓缩水提液得到浸膏,进一步分离浸膏获得其杀螺的有效化学成分^[30]。因此,利用入侵植物提取液对褐云玛瑙蜗牛进行防控,可以达到“以害制害,化害为利”的效果,具有明显的生态与经济效益。

本研究的结果是在无自然条件干扰的实验室中取得的,但在实践应用中,利用入侵植物水提取液防控蜗牛则有它的局限性。由于受自然环境条件的影响,入侵植物水提取液使用的可操作性与效果的稳定性不及农药。比如,提取液容易挥发,土壤对提取液中有效成分的吸收,蜗牛触碰到药剂后产生的防御行为^[27],如闭厴、逃避等,导致其防控效果比化学防治效果差。事实上,即使化学防治也不能达到100%的毒杀效果。所以,利用入侵植物水提取液防控蜗牛,应该根据蜗牛的分布、数量、繁殖期、成熟期及其危害程度的具体情况灵活运用,如把植物水提取液通过浓缩制成浸膏,与常用的杀螺剂按一定比例配制进行防治,既能减少化学药物对自然生境的污染,又能达到有效的防控效果^{[31, 32, 33, 34]}。综合曾玉坤^[25]、胡飞等^[27]及本研究结果来看,薇甘菊、五爪金龙和南美蟛蜞菊杀螺效果较好,具开发植物源杀螺剂的潜力,是最有可能成为植物源杀螺剂的材料,在防控蜗牛危害方面具有可观的应用前景。

入侵植物水提取物对褐云玛瑙蜗牛成体、幼体具有很好的毒杀效果,对蜗牛卵的发育具有显著的抑制作用,并随其水提取液的浓度增加,其杀螺效果增强。入侵植物薇甘菊、五爪金龙和南美蟛蜞菊在农林防害治理中,对保护农、林业生态环境意义重大,具有极大应用价值,其开发潜力需要深入研究。