文章信息
- 景红娟, 何兴东, 郭健潭, 梁玉婷, 陈秀莲, 张斯莲
- JING Hongjuan, HE Xingdong, GUO Jiantan, LIANG Yuting, CHEN Xiu, ZHANG Si
- 阿拉善荒漠4种植物叶RNA/DNA比和RNA/蛋白质比的季节变化
- Seasonal changes of leaf rna/dna ratio and rna/protein ratio of four species plants from the Alxa Desert
- 生态学报, 2015, 35(9): 2998-3005
- Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(9): 2998-3005
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201306161712
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文章历史
- 收稿日期:2013-06-16
- 修订日期:2014-05-22
2. 内蒙古阿拉善盟气象局, 巴彦浩特 750306
2. Alxa Meteorological Bureau, Bayanhaote 750306, China
生物大分子是生物体的重要组成成分,它们的理化性质、结构及其动态特性、分子间相互作用及其协同性等是复杂生命活动的基础[1]。在生物体中,从DNA到RNA再到蛋白质(中心法则),基因表达在不同的水平上进行调控,其中,转录水平上的调控是最重要的,DNA的转录速度决定了细胞中信使RNA(mRNA)的含量[2],mRNA是各种生物蛋白质合成的“模板”,其含量的变化将引起生物体对核糖体需求量的变化。RNA/DNA比可反映DNA的转录速率。同时,mRNA、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)都参与蛋白质的合成,总RNA含量是蛋白质合成的基础,因而RNA/蛋白质比又可表示蛋白质合成时核糖体的翻译效率[3]。
早期研究表明,RNA/ DNA比与细菌生长率呈正相关[4, 5, 6, 7, 8, 9]。随后,在海洋浮游生物[10]和鱼类[11]的研究中,也发现了这一规律。关于RNA/蛋白质比,Klausmeier等[12]认为,该比值的变化可以部分地反映生物体的P/N比,是衡量蛋白质合成过程中对富P的rRNA和富N的“原料”相对需求的一个指标。Karpinets等[13]通过对单细胞微生物的研究也证实了这一点,由RNA和蛋白质含量计算所得的P/N比随具体生长率的增加而升高。Matzek和Vitousek[14]对维管植物研究认为,由于未用于生长的N或P可能被植物储存从而使得植物生长和元素计量比之间的关系变得模糊,他们对温室中营养充足条件下生长的14种维管植物比较后发现,RNA/蛋白质比不随生长率的升高而单调递增。
理论分析表明,RNA/ DNA比和RNA/蛋白质比能够影响蛋白质的合成,进而影响植物个体的生长率,进一步影响植物种群密度、格局以及植物群落稳定性,但这需要实验验证。在内蒙古阿拉善左旗境内,基于流沙基质的进展演替系列为:流动沙地籽蒿(Artemisia sphaerocephalla)群落,半固定、固定沙地油蒿(A. ordosica)群落,固定沙地冷蒿(A. frigida)群落以及淡灰钙土、灰钙土猫头刺(Oxytropis aciphylla)群落[15, 16]。在油蒿+冷蒿群落中,冷蒿正在替代油蒿[17]。为此,本研究选择阿拉善荒漠籽蒿、油蒿、冷蒿和猫头刺4种建群植物为研究对象,分析了4种植物体内RNA/DNA比和RNA/蛋白质比的季节变化特征,我们的研究目标是:(1)揭示随进展演替建群植物体内RNA/DNA比的变化规律;(2)了解演替群落中替代物种与被替代物种体内RNA/蛋白质比的变化规律。
1 研究地区与研究方法 1.1 研究区概况研究区位于阿拉善荒漠的内蒙古阿拉善左旗巴彦浩特镇南8 km (38° 24′59″N,105° 43′31″E),海拔1420 m,属于典型温带干旱区。据阿拉善盟气象站资料,该地年均气温为9.2℃,年均降水量为215.2 mm,主要集中在7—9月份,年均蒸发量为2349.2 mm,年均相对湿度为39%,年均风速为3.1 m/s,风向以西北风为主。植被属半荒漠。
1.2 样品采集和测定在研究区,随机选取籽蒿、油蒿、冷蒿和猫头刺成株各15株,测量株高和冠幅直径。同时,对籽蒿、油蒿、冷蒿和猫头刺各随机选取3株生长良好、大小基本一致的成株作为样株,根部系上红尼龙绳作好标记,开展生长季内采样。
2 012年5月26日、7月26日和9月26日,每天9、12、15 h和18 h分别采集4种植物地上部顶端的幼嫩枝叶,装入封口袋中,用硫酸纸包好,白色线绳绑定后装入液氮罐中带回实验室,转入-70℃低温冰箱中保存。
1.2.1 样品提取方法在实验室,用烘干法[18]测定4种植物各个时点样品的枝叶含水量,植物DNA、RNA和蛋白质用改良一步法[19]提取。
①植物粗提物的提取。分别称取新鲜植物叶0.1000 g放于研钵中,加入液氮充分研磨,转入2 mL离心管中,加入1 mL Biozol试剂,振荡混匀,室温孵育10 min(如不立即提取,样品可在Biozol试剂中4℃保存)。加入200 μL氯仿,振荡均匀(4min)后在冰上孵育10min。然后4 ℃、12 000 r/min离心15 min。离心后样品分为3层:上层无色水相、中间层和底层蓝色有机相。
②RNA的提取。将上层转移到1.5 mL离心管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀。将混合样品置于-20℃孵育20 min以上。然后4℃、12000 r/min离心10 min。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁和管底,弃上清。用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀1次,颠倒洗涤离心管管壁,尽可能让沉淀悬浮。4℃、12000 r/min离心5 min,再次去除上清。室温干燥RNA沉淀,用20 μL DEPC处理水溶解RNA沉淀,将10 μL溶解液转移到新的1.5 mL离心管中用于定量,剩下的用于电泳(检验纯度)。
③DNA的提取。移去上层后,其余部分加入1 mL无水乙醇,颠倒混匀。室温静置5 min,然后4℃、2000 r/min离心8 min。上清(约1.3 mL)转移至新的2 mL离心管用于提取蛋白质,沉淀用于提取DNA。沉淀中加入700 μL预热的抽提液(2%CTAB抽提液置于65℃水浴锅中预热),颠倒混匀。65℃水浴40 min以上。加入等体积的氯仿/异戊醇(24 ∶ 1,V/V),颠倒混匀。4℃、10000 r/min离心10 min。移取上清(800 μL)至新的1.5 mL离心管,加入700 μL的异丙醇,-20℃放置30 min。然后4℃、12000 r/min离心15 min,弃上清。用1 mL 75%乙醇溶液洗涤沉淀,4℃、12000 r/min离心5 min,弃上清。室温晾干DNA沉淀,20 μL DEPC处理水溶解沉淀,将10 μL溶解液转移到新的1.5 mL离心管中用于定量,剩下的用于电泳。
④蛋白质的提取。取沉淀DNA后剩余的上清,转移到新的2 mL离心管中,加入700 μL 异丙醇沉淀蛋白质。颠倒混匀1 min,室温放置10 min。然后4℃、12000 r/min离心10 min。移液枪移除上部上清850 μL。再次加入700 μL异丙醇,沉淀。4℃、12000 r/min离心10 min,弃上清。用1 mL含0.3 mol/L盐酸胍的95%乙醇溶液洗涤蛋白质沉淀。室温放置10 min。4℃、7500 r/min离心8 min,弃上清。重复两次。用1 mL无水乙醇按同样方法再次洗涤沉淀。室温晾干蛋白质沉淀。用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打。55℃水浴使其完全溶解。4℃、10000 r/min离心10 min。将上清转移到新的1.5 mL离心管中,用于定量。
为减小取样不均匀带来的误差,同一个样品均称取约0.1000 g的各3份用于DNA、RNA和蛋白质的提取。同时,每个时间点同种植物从3株固定样株采样为3次生物采样重复,测定过程中每个样测定3次为3次测定重复。
1.2.2 定量方法用移液枪吹打混匀每一管的提取物,在Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计上进行点样,记录读数。每管进行2次。
1.3 数据处理对于RNA含量、DNA含量、蛋白质含量,每个指标、每个时间点位的数据值为3次采样重复和3次测定重复共9个值的平均值。然后,用Excel 2003软件计算平均值和标准误,以月份、物种为横坐标,分别以植物叶RNA、DNA、蛋白质含量以及RNA/DNA比和RNA/蛋白质比为纵坐标作图,用SPSS 13.0进行差异显著性检验分析。
2 结果与分析 2.1 植物叶DNA、RNA和蛋白质含量的季节变化DNA测定结果表明(图 1),籽蒿和猫头刺的DNA含量生长季均为5月最低、7月最高且7月显著高于5、9月;而油蒿和冷蒿则是5月最低、9月最高且5、7、9月逐渐升高。可见,4种植物DNA含量均为5月最低。
RNA测定结果表明,油蒿和冷蒿体内RNA含量的季节变化相似,7月最高;而籽蒿RNA含量5月最高、7月最低,猫头刺RNA含量5、7、9月随季节显著逐渐升高。
值得注意的是,蛋白质含量的季节变化4种植物表现一致,均为7月最低、9月最高,但籽蒿蛋白质含量7月与9月间差异不显著,而油蒿、冷蒿和猫头刺7月与9月间差异显著。
2.2 植物叶RNA/DNA比和RNA/蛋白质比的季节变化结果表明,籽蒿和猫头刺叶RNA/DNA比均在7月最低,但生长季内叶RNA/DNA比籽蒿5月最高而猫头刺9月最高;与此现象相反,油蒿和冷蒿叶RNA/DNA比均在7月最高,但生长季内叶RNA/DNA比油蒿5月最低而冷蒿9月最低。统计表明,从籽蒿到油蒿和冷蒿再到猫头刺4种植物生长季叶RNA/DNA比平均值有逐渐降低的趋势,也就是说,随进展演替,植物叶RNA/DNA比逐渐降低。
分析表明,4种植物叶RNA/蛋白质比均为7月最高,油蒿和猫头刺叶RNA/蛋白质比均为5月最低,且4种植物叶RNA/蛋白质比7月显著高于5月(籽蒿明显高于但不显著)。统计表明,冷蒿叶RNA/蛋白质比生长季平均值高于油蒿。
3 讨论 3.1 植物地上部枝叶中DNA、RNA和蛋白质含量的季节变化特征任东涛和张承烈[20]的研究结果表明,4种生态型芦苇的DNA含量在5月均最高。本研究结果表明,阿拉善荒漠4种建群植物籽蒿、油蒿、冷蒿和猫头刺的叶DNA含量在生长季初期5月均最低。DNA是生物遗传物质,尽管某一物种单个细胞的DNA含量是恒定的[21, 22],但多细胞植物随细胞数量的增加和细胞的伸长,组织中DNA含量也会有较大变化。植物在发育为成年植株的过程中,细胞数目增加和细胞生长的共同作用使植物体表现出明显的伸长或扩大。在阿拉善荒漠,5月正是植物生长初期,细胞数量还在不断增加,因此本研究中4种优势植物叶的DNA含量均在5月最低。4种植物不同的是,籽蒿和猫头刺在7月DNA含量达到最高,而油蒿和冷蒿5月至9月DNA含量逐渐升高,这在一定程度上反映了这几种植物组织细胞的分生进程。
RNA是在特定时间和空间下基因表达的产物,它是蛋白质合成的基础,但它对蛋白质含量的影响又有滞后作用。在本研究中,4种植物叶RNA含量变化无明显的规律,籽蒿RNA含量5月最高、7月最低,油蒿和冷蒿体内RNA含量7月最高,而猫头刺RNA含量生长季逐渐显著升高。这种变化可能预示着,籽蒿早期生长较快,油蒿和冷蒿在雨季到来后生长较快,而猫头刺生长季内不断匀速生长,这与猫头刺的耐旱习性有很大关系。
本研究结果表明,蛋白质含量的季节变化4种植物表现一致,均为7月最低、9月最高。大量研究表明,水分胁迫会导致蛋白质含量下降[23, 24]。造成这种现象原因有两方面:一是活性氧增加,膜脂过氧化加剧,蛋白质合成受抑;二是蛋白酶活性的提高促使蛋白质水解加剧[25],蛋白质降解使蛋白质的成分之一脯氨酸积累,脯氨酸的过量累积反过来影响蛋白质的代谢[26]。在阿拉善荒漠,7月份之前降水量很少,蛋白质的降解和水解会使蛋白质含量降低。同时,植物细胞在生长过程中,生长着的细胞具有旺盛的代谢能力,不断进行光合作用,许多代谢产物(淀粉、可溶性糖等)增加,积累于液泡中,使细胞的干重随着体积的增加而增加,则单位干物质中蛋白质含量相对降低。因此,本研究中4种优势植物蛋白质含量在7月均最低。然而,进入9月末后,气温下降,植物对低温的适应常常和体内发生的一些生理生化方面的变化相联系,包括基因表达的变化,激素水平的改变,可溶性糖、氨基酸和有机酸的增加,渗透保护物和保护蛋白的积累以及膜脂组成的改变[27, 28, 29]。武雁君和刘建辉[30]研究表明,在一定范围内随温度降低和低温处理时间的延长,能够诱导植物产生更多的可溶性蛋白,从而减少细胞失水,降低低温给细胞带来的伤害。杜永吉等[31]研究表明,随温度降低,结缕草3个品种叶片的可溶性蛋白含量增加。因此,4种植物体内蛋白质含量在9月均最高。可见,夏季高温时段蛋白质含量的降低预示着植物忍耐胁迫的程度,而秋末低温时段蛋白质含量的增加又预示着植物储藏营养用以过冬并为来年生根发芽奠定营养基础。
3.2 植物叶中RNA/DNA比与RNA/蛋白质比的季节变化特征承前所述,国外学者研究表明,细菌、浮游生物和鱼类的生长率随其体内RNA/DNA比增大而增大[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11],但植物鲜见这方面的报道。本研究结果表明,从籽蒿到油蒿和冷蒿再到猫头刺4种植物叶RNA/DNA比生长季的平均值显现出逐渐降低的趋势,即随进展演替生长季建群植物叶RNA/DNA比逐渐降低,也就是说,演替早期植物生长季具有较大的RNA/DNA比,而演替后期植物生长季具有较小的RNA/DNA比。Tilman[32]曾指出,演替早期的物种生长较快,而演替后期的物种与早期的物种相比生长速度较慢。综合两者分析,可以推知阿拉善荒漠演替早期植物生长季RNA/DNA比较大、生长较快,而演替后期植物生长季RNA/DNA比较小、生长较慢。事实上,对籽蒿、油蒿、冷蒿和猫头刺成株各15株的测量结果表明,4种植物成株的株高依次为(103.33±2.73)、(72.60±2.87)、(48.13±3.45)和(26.27±1.12) cm,冠幅直径依次为(118.60±3.71)、(103.47±2.56)、(56.40±7.21)和(13.67±1.23) cm,这种进展演替系列建群植物个体从大到小的变化在一定程度上支持本研究的分析。进一步分析表明,籽蒿和猫头刺叶RNA/DNA比在7月均最低,这和蛋白质的变化相一致,但叶RNA/DNA比籽蒿5月最高而猫头刺9月最高,这和RNA的变化相一致,这预示阿拉善荒漠演替早期植物生长季前期生长较快,而演替后期植物生长季后期生长较快。
在油蒿+冷蒿演替群落中,冷蒿为替代种而油蒿为被替代种[17],理论上,在处于演替的生境中替代种的生长率肯定高于被替代种,相应地,按照生长率假说,替代种体内的RNA/蛋白质比应高于被替代种[14, 33]。本研究结果表明,生长季冷蒿叶RNA/蛋白质比平均值高于油蒿,这一结果符合生长率假说。进一步分析表明,4种植物叶RNA/蛋白质比7月均最高,这与蛋白质的变化密切相关,4种植物叶蛋白质含量7月较低,导致7月份这4种植物叶RNA/蛋白质比较高。另一方面,RNA/蛋白质比可表示蛋白质合成时核糖体的翻译效率[3],而RNA转译成蛋白质必定需要一定的时间[34, 35, 36, 37],即RNA转译成蛋白质具有时滞效应,反过来说,由于4种植物叶RNA/蛋白质比在7月最高,为后来蛋白质合成奠定了基础,因而,如上所述,9月份4种植物叶蛋白质含量均达到较高水平。因此,我们认为,用RNA/蛋白质比反映植物成株现时生长率有点勉强,但用其反映成株紧邻将来生长率比较可行。
总之,在阿拉善荒漠,随进展演替,建群植物RNA、DNA和蛋白质含量均表现出明显的季节变化,由此引起植物体内RNA/DNA比与RNA/蛋白质比的季节变化,进而可能影响植物的现时生长与紧邻将来生长。
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