空气微生物是指空气中细菌、霉菌和放线菌等有生命的活体，主要来源于土壤、水体、动植物和人类，此外污水处理、动物饲养、发酵过程和农业活动等也是空气微生物的重要来源^{[1, 2, 3, 4]}。已知存在空气中的细菌及放线菌有1200种，真菌有40000种^[5]。空气微生物不仅具有重要的生态系统功能，还与空气污染、环境质量和人体健康密切相关^[6]。了解城市空气微生物群落特征、物种组成及浓度，对控制城市微生物污染、改善环境质量、维持人群健康和提高工农业生产具有重要的理论和实际意义。国内外学者已经对城市不同功能区、 垃圾填埋场、污水处理厂、养殖环境等空气微生物区系、时空分布特征进行研究^{[1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]}。但这些研究大多采用传统微生物培养方法^{[15, 16, 17, 18, 19, 20]}，由于“可培养类”微生物仅占总微生物的不到1%^{[21, 22]}，并且还有部分微生物处于活的不可培养状态，加上培养结果受培养基组分影响较大，导致测得的数据与实际情况有较大偏差。为了较准确的反映空气微生物群落和生态功能，需要从空气微生物种类、群落结构、功能多样性以及生物量等层次来研究。新发展的基于微生物群落代谢单一碳源特征的BIOLOG方法能够弥补传统方法的不足，底物碳源的多样性决定了BIOLOG微平板可以提供大量多维数据，且能够比较样品间微生物群落差异，较全面地表征微生物群落结构、总体代谢活性与功能信息，该方法已在微生物鉴定、污水处理工艺、污染土壤修复中得到广泛应用。

本文以青岛市5个城市功能区(市区街道、海滨区域、饮用水源地、城市生活垃圾填埋场和人工湿地污水处理系统)为研究对象，应用BIOLOG方法分析空气微生物群落碳源代谢功能多样性，阐明空气微生物群落代谢与环境相关性。对了解沿海城市不同功能区空气微生物特征及其对大气环境和人体健康的影响具有重要意义。

选择青岛市区街道(抚顺路青岛理工大学段)、海滨区域(鲁迅公园)、饮用水源地(棘洪滩水库)、垃圾填埋场(小涧西生活垃圾综合处理厂)、人工湿地(胶南人工湿地污水处理系统)5个功能区作为采样地点。其中，(1)抚顺路位于青岛市市北区，是青岛市主要交通枢纽，人流量和车流量较大，汽车尾气和扬尘污染较严重；(2)鲁迅公园位于青岛市市南区，南面紧邻大海，长约1 km，占地面积0.04 km²，绿化面积75%以上，是青岛4A级旅游景点，冬季人流量较少；(3)棘洪滩水库位于青岛市城阳区，是引黄济青工程唯一调蓄水库，库区面积14.4 km²，是青岛市主要饮用水源地，供应青岛市50%以上居民用水，周围是农田，人流量较少；(4)小涧西生活垃圾综合处理厂位于青岛市城阳区，是青岛市内六区唯一的生活垃圾填埋场，设计库容7.1×10⁶ m³，占地面积0.66 km²，填埋区面积0.27 km²，绿地率41.25%，实际日填埋量3500 t/d，垃圾渗滤液经垂直和水平收集系统收集后排入污水处理厂进行处理；(5)人工湿地污水处理系统位于青岛市黄岛区，东南面紧邻黄海，采用自由表面流芦苇湿地工艺，由99个并联运行湿地单元组成，每个单元大小为140 m×32 m，总占地面积76.7 km²，处理规模3×10⁴ m³/d，污水来源为生活污水和工业废水(约1 ∶ 1)。

采样时间为2013年1月1日—5日，采用SAS ISO 100空气微生物采样器采集空气微生物样品，空气流量100 L/min，采样时间30 min。采样后取下凝胶膜，加到100 mL灭菌生理盐水中，摇床震荡10 min，凝胶膜溶解后作为接种液。采样期间利用TASI-620数字式温湿度计测定采样环境温度和湿度，利用TASI-641风速仪测定风速(表 1)。

接种混匀的接种液于BIOLOG-GN板中，每孔接种量125 μL，接种后的BIOLOG-GN板置于25 ℃恒温培养箱中培养^[23]，每隔24 h于BIOLOG读数器上读数，波长590 nm，直至光密度值稳定为止，整个培养过程共持续8d。

平均光密度值(AWCD)计算方法^[23]：AWCD=∑(C-R)/n，式中C为反应孔光密度值，R为对照孔光密度值，n为底物数量，对于不同BIOLOG微平板n值不同，BIOLOG-GN板为95。

选用72 h光密度值计算5个不同功能区空气微生物群落多样性指数^[24]： Shannon指数(H′)、McIntosh指数(U)和Simpson指数(D)。计算公式见表 2。

表2 空气微生物群落多样性指数计算方法 Table 2 Computational methods for diversity index of airborne microbial community

多样性指数 Index of diversity	用途 Function	公式 Formula	备注 Remarks
Shannon指数 Shannon indexes H′	评估丰富度	H′=－∑PilnPi	pi为第i孔相对光密度值(C-R)与整个平板相对光密度总和的比率 ni表示第i孔与对照孔的差值(ni=Ci-R)
McIntosh指数 McIntosh indexes U	度量群落物种均一度指标
Simpson指数 Simpson indexes D	反映微生物群落优势度指标	D=1－∑Pi2

表选项

选取72 h平均光密度值(AWCD)利用SPSS 17.0软件进行主成分分析(PCA)，利用CANOCA软件进行典范对应分析(CCA)^[25]。

平均光密度值(AWCD)能够衡量空气微生物利用不同碳源的整体能力，表征微生物生理活性，从代谢水平上揭示空气微生物群落功能多样性。青岛市5个功能区AWCD随时间延长而增大，最初48 h内曲线较平缓，72 h AWCD值进入指数增长期，192 h达到稳定状态(图 1)。方差分析表明，海滨区域和饮用水源地空气微生物碳源代谢水平与其余各功能区存在显著性差异(P<0.05)。培养过程中，人工湿地、市区街道和垃圾填埋场空气微生物碳源代谢水平较低，在192 h时AWCD值仍小于0.1，而海滨区域和饮用水源地空气微生物碳源代谢水平相对较高。5个功能区AWCD值变化趋势不同，表明各功能区空气微生物碳源利用能力、丰度等存在差异。

图1 青岛市5个功能区空气微生物AWCD变化 Fig.1 Average well color development (AWCD) changes of airborne microbes at five city functional regions in Qingdao City

图选项

BIOLOG-GN板包含95种碳源，根据碳源官能团可将其划为6类，其中糖类(Carbohydrates)30种、羧酸类(Carboxylic acids)24种、氨基酸类(Amino acids)20种、胺/氨类(Amines/amides)6种、聚合物类(Polymers)5种、其他(Miscellaneous)10种^[26]。5个功能区空气微生物对6类碳源利用程度存在差异，海滨区域和饮用水源地空气微生物碳源代谢水平高于其他功能区。空气微生物碳源代谢优势群落依次为羧酸类代谢群落、糖类代谢群落、氨基酸类代谢群落。5个功能区空气微生物对羧酸类和糖类碳源利用程度均较高，对其它化合物类利用程度较低，其中，对胺/氨类代谢水平最低，市区街道、垃圾填埋场和饮用水源地空气微生物基本不能代谢这类碳源。同一功能区对不同碳源的利用程度也存在差异(图 2)。

图2 青岛市5个功能区空气微生物群落对BIOLOG平板碳源的相对利用率 Fig.2 Relative utilization ratios of carbon sources in BIOLOG plate by the airborne microbes at five city functional regions in Qingdao City

图选项

采用Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数分析5个功能区空气微生物群落功能多样性，3种多样性指数反映了空气微生物群落功能多样性不同侧面，其中，Shannon指数受群落物种丰富度影响较大，反映了微生物群落物种种数及种间个体分配的均匀性；Simpson指数反映了群落中最常见的物种，是评估微生物群落优势度的指标；McIntosh指数则是度量群落物种均一度的指标。可以看出，Shannon指数饮用水源地最低，其次为海滨区域，其余3个功能区基本相同，Simpson指数除饮用水源地较低外，其余4个功能区基本相同，McIntosh指数差异较大，饮用水源地和海滨区域明显高于其余3个功能区(表 3)。

利用主成分分析法(PCA)分析青岛市5个功能区空气微生物群落代谢功能，共提取2个主成分，其中主成分1(PC1)方差贡献率37.6%，主成分2(PC2)方差贡献率23.0%，累计方差贡献率60.6%，能够解释原有变量大部分变异。在PC1上载荷大于0.9的基质有15种，主要是羧酸类、氨基酸及糖类，其中D-葡萄糖二酸载荷最大(0.968)；在PC2上载荷大于0.9的基质有9种，主要是氨基酸和糖类，其中D-葡萄糖-6-磷酸载荷最大(0.984)(表 4)。PC1、PC2上载荷大于0.9的基质类型和利用率较高的碳源类型一致。

根据青岛市5个功能区空气微生物群落碳源代谢相似性可以将5个功能区归为3类，其中市区街道、人工湿地及垃圾填埋场归为一类；海滨区域归为一类；饮用水源地归为一类。在PC1上，3类区域空气微生物碳源代谢差异显著，碳源利用谱容易区分。考察成分载荷矩阵可知，羧酸类在PC1上载荷较大，是碳源代谢差异区域性的主要分异碳源类型(图 3)。

图3 5个功能区空气微生物群落BIOLOG微平板中底物碳源代谢的主成分分析 Fig.3 Principal Component analysis (PCA) of BIOLOG plate data profiles revealed the patterns of microbial communities at five city functional regions in Qingdao City

图选项

研究表明，非生物因素(温度、湿度、海拔、风速、风向等)对空气微生物群落碳源代谢强度和单一碳源利用能力有不同程度影响^{[27, 28, 29]}。CCA典范对应分析能够从统计学角度分析环境因子和空气微生物群落碳源代谢相关性，揭示不同环境条件下微生物群落结构变化原因。从青岛市5个功能区空气微生物群落碳源代谢强度与环境因子CCA分析排序图中可以看出，温度、湿度与人工湿地、垃圾填埋场、市区街道空气微生物群落碳源代谢水平呈正相关，与海滨区域、饮用水源地呈负相关；风速与人工湿地、垃圾填埋场、市区街道空气微生物群落碳源代谢水平呈负相关，与海滨区域、饮用水源地呈正相关(图 4)。

图4 5个功能区碳源代谢强度与环境因子CCA分析排序 Fig.4 A two-dimensional graph analysis of canonical correspondence analysis (CCA) coordination for AWCD of five airborne microbial community and environment factors

图选项

不同环境条件或不同环境介质微生物群落碳源代谢强度、碳源代谢类型差异显著，微生物群落碳源代谢呈现区域性，并且分异这种区域性的碳源类型随环境条件和环境介质改变而不同^{[23, 27, 29, 30, 31]}。

AWCD可以评估空气微生物利用不同碳源的整体能力，从功能代谢水平上揭示空气微生物群落结构多样性，是反映空气微生物活性、描述空气微生物群落功能多样性的重要指标^[29]。青岛市5个功能区空气微生物群落碳源代谢强度存在差异，其中，海滨区域、饮用水源地空气微生物群落碳源代谢强度较高，人工湿地、市区街道和垃圾填埋场空气微生物群落碳源代谢强度较低。研究表明，高辐射、寡营养及干燥环境使得一些生长缓慢、产孢子和芽孢的类群(如放线菌和芽孢杆菌)占优势，导致碳源利用能力降低^[32]，而BIOLOG方法对生长缓慢、不能很好利用BIOLOG板中碳源的微生物反映能力较差^[33]。海滨区域和饮用水源地环境湿度较大，导致空气微生物生理活性和碳源利用强度相对较高。对比BIOLOG方法在土壤微生物群落代谢中的研究结果^{[34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43]}，发现空气微生物群落碳源代谢整体水平较低，可能与空气微生物组成及采样季节有关^[44]。

Shannon指数(H′)、McIntosh指数(U)和Simpson指数(D)分别从微生物群落丰富度、均一性及常见种群优势度等方面反映空气微生物群落多样性。青岛市不同功能区空气微生物群落丰富度和优势度接近，但群落均一度存在差异，饮用水源地和海滨区域空气微生物群落物种较均一，可能由于该功能区环境湿度大，昼夜温差小，为一些微生物种群提供适宜生存条件^{[27, 29]}，同时，冬季海滨区域和饮用水源地受人为因素影响较少，扬尘等对空气微生物群落组成扰动较小，从而形成相对均一稳定的空气微生物群落。

青岛市5个功能区空气微生物群落碳源代谢类型和代谢水平存在差异，且呈现区域性。海滨区域空气微生物群落碳源代谢类型主要是糖类、氨基酸类、羧酸类及聚合物类，对糖类代谢水平最高；饮用水源地碳源代谢类型主要是聚合物类、羧酸类、氨基酸类及糖类，对聚合物类碳源代谢水平最高；市区街道、人工湿地和垃圾填埋场空气微生物群落主要碳源代谢类型是羧酸类、糖类；5个功能区空气微生物群落对羧酸类碳源代谢水平均较高。研究发现，空气微生物群落碳源代谢水平与所处环境条件具有相关性，环境条件影响空气微生物的来源，同时构成微生物生存的特殊生境，影响其生理活性，使空气微生物群落碳源代谢差异呈现区域性^{[17, 19]}。冬季人工湿地、垃圾填埋场和市区街道均有湿度低、温差大的特点，并且垃圾填埋场和市区街道空气微生物群落组成受人为活动影响较大，但研究发现人工湿地、市区街道和垃圾填埋场空气微生物群落碳源代谢相近，推测这3个功能区空气微生物群落组成及生理活性受温度、湿度等环境因子影响较大。海滨区域和饮用水源地尽管有着相似的温度、湿度条件，但由于海水环境和淡水环境差异，形成空气微生物生境差异，同时海风也会影响空气微生物群落组成，导致海滨区域和饮用水源地空气微生物群落碳源代谢存在差异。

(1)青岛市5个功能区冬季空气微生物群落碳源代谢强度和代谢类型存在差异。海滨区域和饮用水源地空气微生物群落碳源代谢强度明显高于其他功能区，且碳源代谢类型丰富，代谢水平相对较高。

(2)青岛市5个功能区冬季空气微生物丰富度和种群优势度接近，而群落物种均一度存在差异。空气微生物群落碳源代谢差异呈现区域性，可以归为3类，分别为:①海滨区域、②饮用水源地、③人工湿地、市区街道和垃圾填埋场。羧酸类是分异不同功能区空气微生物碳源代谢差异区域性的主要碳源类型。

(3)BIOLOG方法能够从微生物群落碳源代谢强度、碳源代谢类型及碳源利用区域性分异等方面研究微生物群落代谢，但只能反映在BIOLOG-GN板上能够生长的微生物。要全面研究空气微生物群落结构特征，还需要结合基因多样性方面的研究。