文章信息
- 肖猛, 李群, 郭亮, 唐琳, 王丽, 陈放
- XIAO Meng, LI Qun, GUO Liang, TANG Lin, WANG Li, CHEN Fang
- 四川西部濒危植物桃儿七遗传多样性的RAPD分析
- RAPD analysis of genetic diversity of an endangered species Sinopodophyllum hexandrum(Royle) Ying from Western Sichuan Province, China
- 生态学报, 2015, 35(5): 1488-1495
- Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(5): 1488-1495
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201309272376
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文章历史
- 收稿日期:2013-09-27
- 修订日期:2014-07-14
2. 四川旅游学院, 成都 610100;
3. 四川师范大学生命科学学院, 成都 610066
2. Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China;
3. College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, China
桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying;分类学上的同种异名有S. emodi (Wall) Ying,Podophyllum hexandrum Royle,P. emodi Wall;又名西藏鬼臼)是小檗科桃儿七属单一种的多年生草本植物[1]。桃儿七主要生长在喜马拉雅及临近地区。在我国,主要分布在海拔2700到4500 m的西藏、四川、云南等高山地区,其他的省(自治区)如陕西、甘肃、青海、宁夏以及湖北亦有分布。据调查,桃儿七在四川省主要分布于阿坝州、甘孜州以及凉山州木里县等地。桃儿七是一种传统的民间药用植物,其根和根茎中的主要成分之一鬼臼毒素(podophyllotoxin)是人工合成抗癌药物(VP16,依托泊苷;VM26,特尼泊苷)的前体[2]。桃儿七也是一种叶奇、花美、果实具有多种用途的植物[3]。近年来由于人类砍伐等干扰活动加剧,桃儿七生境受到破坏,加上根茎可入药,采挖过量,致使种群数量迅速减少,已被国家列为珍稀濒危保护植物[4]。因此,很有必要进行桃儿七保护遗传学研究,探讨它的濒危机制。有关桃儿七遗传多样性研究,先前的工作仅在细胞学有关核型研究方面的报道[5, 6]。然而,细胞学研究观察到的植物信息量非常有限,要想更深入地了解桃儿七的遗传多样性,必须对其进行更深层次(如DNA水平)的遗传多样性研究。目前,这方面的研究在国内外仅见少量报道[7, 8, 9].
在研究植物多样性的众多分子标记技术中,RAPD(Random amplified polymorphic DNA)是应用最广泛的技术方法之一。RAPD标记是以一段随机寡核苷酸序列为引物(长度一般为10 bp)、以基因组DNA为模板进行PCR扩增的一种分子标记技术[10]。该技术具有简单易行、不需要事先知道材料的基因信息、能够覆盖整个基因组以及显性遗传标记等特点,且从理论上RAPD可提供的信息量是无限的。目前,RAPD标记在重要作物林木遗传图谱构建、基因定位与分离、种质资源评估、栽培植物品种鉴定、野生植物天然种群的遗传结构分析以及种间或属间遗传关系分析等领域的研究已有大量报道[11]。近年来,应用RAPD技术在种群水平上进行濒危植物保护生物学的研究已取得显著的进展,主要是揭示濒危物种的遗传多样性,探讨濒危机理,提出保护策略建议。目前在国内应用RAPD技术进行遗传多样性研究所涉及的濒危植物如长叶红砂Reaumuria trigyna[12],崖柏Thuja sutchuenensi[13],明党参Changium smyrnioides[14]、水杉Metasequoia glyptostroboides[15]、版纳青梅Vatica guangxiensis[16]、华木莲Sinomanglietia glauca [17]、闽楠Phoebe bournei[18]、银杉Cathaya argyrophylla[19]、五针白皮松Pinus squamata[20]等。本文选用了RAPD分子标记技术对川西高原地区桃儿七分布较多的5个地区7个野生种群的遗传多样性水平和遗传结构进行检测,旨在揭示桃儿七自然种群的遗传结构和遗传多样性水平,从分子水平上探讨它的濒危机制,为有效保护桃儿七遗传资源提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料根据四川大学植物标本馆的文献记载和野外实地调查桃儿七的分布情况,于5月下旬至6月下旬在桃儿七分布较多的四川省西部高原地区采集了7个种群(最远的两种群间直线距离为567.5 km,最近的两种群距离为12.5 km)、合计140份材料的样品。7个种群在四川西部的分布见图 1。各种群所在地及生境状况见表 1。在每个桃儿七种群中随机选取20个具有代表性的样株,每个样株间隔距离5 m以上,每株采集的幼嫩叶片迅速装入自封袋中并用硅胶干燥保存,用于总基因组DNA的提取。
种群分布 Location | 样品采集地 Origin | 海拔/m Altitude | 生境 Habitat | 采样数 Sample size (N) |
两河口 | 松潘县两河口 | 3150 | 与野樱桃、黄连、高山柳、枸杞混生,林间阴湿,小片、零星生长在灌木下 | 20 |
牟尼沟 | 松潘县牟尼沟 | 3050 | 与柏树、松树、云杉、沙棘、杜鹃、高山柳混生,附近有小溪,小片生长在灌木下、斜草坡空地上 | 20 |
打西坝 | 红原县打西坝 | 3450 | 与沙棘、大黄、黄荆、高山柳、忍冬混生,土壤潮湿,小片生长在灌木下 | 20 |
杉耳九沟 | 红原县杉耳九沟 | 3350 | 与云杉、高山柏、落叶松、杜鹃、高山柳、绣线菊混生,附近有溪水山沟,零星生长在沟边、灌木下 | 20 |
木斯沟 | 金川县木斯沟 | 3150 | 与冷杉、云杉、白杨、高山柏、花椒、小叶青杠、马桑混生,林间阴湿,零星生长在林间水沟边、灌木下 | 20 |
榆林宫 | 康定县榆林宫 | 3000 | 与高山柳、多种灌木混生,土壤潮湿,小片、零星生长在灌木下、刺丛间 | 20 |
鸭嘴牧场 | 木里县鸭嘴牧场 | 3300 | 与冷杉、云杉、沙棘、杜鹃、高山柳、黄连、小叶青杠混生,光线较充足,附近有小溪,土壤湿润,小片生长在灌木下、石隙间、河滩空地 | 20 |
采用改进的改良CTAB法[11]提取桃儿七基因组总DNA。总DNA溶于0.1×TE缓冲液,分装后放入-20 ℃储存或放入4 ℃待用。采用来自Operon公司(且本实验室现有)及根据相关资料设计并由上海生工公司合成的10碱基RAPD引物(120条),从中筛选出12条具多态性和稳定性的引物在PTC-100TM中进行扩增。在预实验的基础上经过比较和优化确定20 μL反应体系为:1×PCR buffer(10 mmol/L Tris-HCl,pH值8.3,50 mmol/L/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2),模板10—30 ng、1 UTaq聚合酶、0.4 mmol/L dNTPs、0.6 μmol/L引物、37 ℃的退火温度、0.001%的白明胶。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min,37 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,然后进行40个循环:94 ℃变性1 min,37 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循环结束后72 ℃延伸10 min。PCR产物在含0.5% EB的1.5% 琼脂糖凝胶中以1×TAE缓冲液为介质电泳,以100 bp Marker作为标准分子量对照,在Gene genius Bioimaging System凝胶成像仪上照相。
1.2.2 统计分析RAPD扩增产物电泳图谱中的每一条带均视为一个分子标记(marker),代表一个引物的结合位点。按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计,有带(包括弱带)的记为“1”,无带的记为“0”的格式输入构成的RAPD表型数据矩阵用于分析。采用POPGENE 1.31 软件对全部种群和各个单种群分别进行遗传参数分析[21],分别计算了多态位点百分率(PPB)、观测等位遗传标记数(Ao)、有效等位遗传标记数(Ae)、种群总遗传多样性(Ht)、种群内遗传多样性(Hs)、各种群间的遗传分化指数(Gst)、基因流(Nm)、Nei's基因多样性(He),Nei's遗传一致度(I)和遗传距离(D)。Shannon's信息指数(Ho)也被用来检测种群遗传多样性水平。Ho=-∑Pilog2 Pi,Pi为第i条带的表型频率。根据Nei's遗传距离,按不加权成对算术平均法(UPGMA)建立系统聚类分枝树状图。另外,分子方差分析方法(AMOVA)也被用来分析种群间和种群内的分子变异[22]。
为了检测种群间遗传距离和地理距离的相关性,运用TFPGA1.3程序软件[23]进行了Mantel测试(计算了5000个置换)。
2 结果与分析 2.1 扩增的多态性从120个引物中筛选出至少能扩增出2条及以上多态性带的12个RAPD引物对桃儿七7个种群的140植株个体的DNA样品进行了PCR扩增。不同引物扩增的多态位点数不等,形成了带型丰富、片断大小及其组合不同的电泳图谱(图 2)。
扩增片段长度约为200—1500bp,平均每个引物可扩增出9.3条带,其中多态性带平均为2.7条(表 2),引物Psh17扩增的条带数最多(12条)且多态性带数亦最多(4条),引物Psh7和Psh11扩增的条带数最少(7条)且多态性带数亦最少(2条)。
引物编号 Code of the primer | 序列(5'-3') Sequence 5 '→3' | 扩增条带数 No. amplified bands | 多态性条带数 No. polymorphicb ands |
Psh 2 | GTAACTTGCT | 10 | 3 |
Psh 4 | CCGAATTCCC | 9 | 3 |
Psh 5 | CCCGCAGAGC | 9 | 2 |
Psh 7 | GTTCCCTTGC | 7 | 2 |
Psh 8 | GGCAGGCTCG | 10 | 4 |
Psh 9 | GGGACTCACA | 12 | 3 |
Psh 10 | CCAGTCTCCA | 8 | 2 |
Psh 11 | TCTTCCGTCA | 7 | 2 |
Psh 12 | GGGCTTCCCT | 8 | 2 |
Psh 14 | CGAAGGACTA | 11 | 3 |
Psh 15 | CGACGTTGTA | 8 | 2 |
Psh 17 | GACGAGGTGC | 12 | 4 |
总计Total | 111 | 32 |
用POPGENE1.31软件对桃儿七7个种群的遗传多样性进行统计分析,结果如表 3所示。打西坝(DXB)、杉耳九沟(SEJG)、木斯沟(MSG)、两河口(LHK)、牟尼沟(MNG)、榆林宫(YLG)、鸭嘴牧场(YZMC)7个种群的多态性位点百分率(PPB)分别为11.71%、9.01%、4.50%、9.91%、16.22%、9.01%、11.71%。可见,牟尼沟(MNG)种群的多态位点百分率最高,木斯沟(MSG)种群的多态位点百分率最低。在种群水平上,7个种群的多态位点百分率(PPB)平均为10.30%;Nei's遗传多样性(亦称期望杂合度,He)在0.0065—0.0362之间,平均值为0.0193。Shannon's信息指数(亦称香农指数)在0.0110—0.0587之间,平均值为0.0269。各种群的Shannon's信息指数大小变化趋势与多态位点百分率一致。在物种水平上,其多态位点百分率、期望杂合度、Shannon指数分别为28.83%、0.0622、0.0987。RAPD标记的遗传多样性分析表明桃儿七种群存在较低的遗传多样性。
种群分布 Location | 多态位点百分率/% PPB,Percentage of polymorphic bands | 观测等位基因数 Ao,Number of alleles per locus | 有效等位基因数 Ae,Effective number of alleles per locus | 期望杂合度 He, Gene diversity | 香农指数 Ho,Shannon's information index |
打西坝 | 11.71 | 1.1171 | 1.0322 | 0.0224 | 0.0370 |
杉耳九沟 | 9.01 | 1.0901 | 1.0282 | 0.0185 | 0.0303 |
木斯沟 | 4.50 | 1.0450 | 1.0105 | 0.0065 | 0.0110 |
两河口 | 9.91 | 1.0991 | 1.0274 | 0.0189 | 0.0320 |
牟尼沟 | 16.22 | 1.1622 | 1.0569 | 0.0362 | 0.0587 |
榆林宫 | 9.01 | 1.0225 | 1.0157 | 0.0266 | 0.0454 |
鸭嘴牧场 | 11.71 | 1.1171 | 1.0219 | 0.0166 | 0.0297 |
种群水平 Population level | 10.30 | 1.1030 | 1.0285 | 0.0193 | 0.0269 |
物种水平 Species level | 28.83 | 1.2883 | 1.1011 | 0.0622 | 0.0987 |
桃儿七种群总的遗传多样性(Ht)为0.0622,种群内的遗传多样性(Hs)为0.0193,表明总的遗传变异主要来自于种群间。根据总的遗传多样性和种群内遗传多样性计算不同种群间的分化水平(Gst)所分析的7个桃儿七种群间的Gst为0.6906,即表明总的遗传变异中有69.06%的变异存在于种群间,种群内的遗传变异为30.94%,说明了种群间的分化水平非常高。种群间的基因流(Nm)为0.2240。
利用分子方差变异分析(AMOVA)对7个桃儿七自然种群的遗传分化系数进行了分析,结果表明:总的遗传变异中有68.74%的变异发生在种群间,有31.26%的变异发生在种群内,种群间和种群内的变异均极显著(P < 0.002)(表 4)。比较发现,AMOVA分析所得结果与Nei's遗传多样性分化分析所得结果基本一致,表明桃儿七种群间已出现了非常大程度的遗传分化。
变异来源 Source of variation | 自由度 df | 总方差 Sum of squares | 平均方差 Mean squares | 变异组分 Variance component | 总变异百分率 Total Variance/% | P |
种群间 Among population | 6 | 344.77 | 57.46 | 2.8092 | 68.74 | < 0.0002 |
种群内 Within population | 133 | 169.90 | 1.28 | 1.2774 | 31.26 | < 0.0002 |
Nei's遗传一致度和遗传距离的结果见表 5。桃儿七各种群间遗传一致度(I)值的变化范围为0.9189—0.9883,打西坝和榆林宫种群的遗传一致度最小(一致度值为0.9189),两河口和牟尼沟种群遗传一致度最高(0.9883);桃儿七各种群间遗传距离值的变化范围为0.0118—0.0845,其中DXB和YLG的遗传距离最大(0.0845),LHK和MNG的遗传距离最小(0.0118)。对桃儿七7个种群的Nei遗传距离与地理距离进行了Mantel统计检验,结果表明,种群间的遗传距离和地理距离之间没有明显的相关性(r = 0.3747,P = 0.0350),即遗传多样性的分布呈一定的地理趋势。
种群分布Location | 打西坝 | 杉耳九沟 | 木斯沟 | 两河口 | 牟尼沟 | 榆林宫 | 鸭嘴牧场 |
打西坝 | - | 0.9815 | 0.9691 | 0.9203 | 0.9334 | 0.9189 | 0.9264 |
杉耳九沟 | 0.0187 | - | 0.9855 | 0.9362 | 0.9474 | 0.9310 | 0.9380 |
木斯沟 | 0.0313 | 0.0146 | - | 0.9504 | 0.9623 | 0.9313 | 0.9380 |
两河口 | 0.0830 | 0.0660 | 0.0509 | - | 0.9883 | 0.9429 | 0.9431 |
牟尼沟 | 0.0689 | 0.0540 | 0.0384 | 0.0118 | - | 0.9490 | 0.9515 |
榆林宫 | 0.0845 | 0.0715 | 0.0712 | 0.0588 | 0.0524 | - | 0.9823 |
鸭嘴牧场 | 0.0765 | 0.0640 | 0.0614 | 0.0586 | 0.0497 | 0.0178 | - |
聚类结果(图 3)表明,7个自然种群聚成两支:YZMC、YLG、MNG 和LHK聚成一支;MSG、SEJG和DXB聚成另外一支。即MNG和LHK种群遗传距离最小,优先聚在一起,然后再与YLG和YZMC聚在一起;MSG和SEJG聚类后,再与DXB种群聚成另外一支。聚成一支的表明它们有较近的亲缘关系。结合桃儿七种群地理分布,聚类情况为位于北部的打西坝、杉耳九沟及中部木斯沟3个种群聚在一起;位于北部的两河口和牟尼沟2个种群聚在一支,再和位于南部的榆林宫、鸭嘴牧场2个种群聚在一起。
3 结论与讨论 3.1 桃儿七的遗传多样性通过RAPD标记对桃儿七7个自然种群的研究表明:川西地区桃儿七7个自然种群在物种水平的多态位点百分率(PPB)为28.83%,稍高于采用AFLP标记对相同的这7个种群在物种水平的PPB(25.93%)[7];但它比分布在我国云南的6个桃儿七种群PPB(DALP分析的PPB = 69.33%6)[8]以及分布在印度Chanb和Kullu地区的Podophyllum.hexandrum(桃儿七的同种异名) PPB(RAPD标记的PPB = 100%)都低得多[9];也比我国已进行RAPD标记的一些濒危植物如长叶红砂(PPB = 89.47%)[12],崖柏(PPB = 72.09%)[13],明党参(PPB = 69%)[14]、水杉(PPB = 52.89%)[15]、版纳青梅(PPB = 53.68%)[16]、华木莲(PPB = 53.22%)[17]的多态位点百分率都要低得多些;还稍低(或者说接近)于闽楠(PPB = 36.88%)[18]、银杉(PPB = 32%)[19]; 仅比极度濒危植物五针白皮松(PPB = 6.45%)[20]要高。Shannon's信息指数表明的结果是物种水平的值(Ho = 0.0987)高于种群水平(Ho = 0.0269)。本研究中桃儿七的Nei's遗传多样性(He)为0.0337也是明显低于前叙的濒危植物如版纳青梅(He = 0.1686)、华木莲(He = 0.1847),仅比极度濒危植物五针白皮松(He = 0.019)要高些。以上数据都表明川西地区桃儿七的遗传多样性处于较低的水平。
在所有种群中,牟尼沟(MNG)种群的遗传多样性水平最高(PPB为16.22%,He为0.0362),打西坝(DXB)种群次之(PPB为11.71%,He为0.0224),木斯沟(MSG)种群的遗传多样性水平最低(PPB为4.50%,He为0.0065)。通过实地考察发现,所有种群的生境都遭受不同程度的破坏,估计是天保工程实施以前,大量砍伐林木所致。遗传多样性最高的牟尼沟种群位于自然保护区,生境保护相对完好;而遗传多样性相对低的木斯沟种群,当地居住有村民,每天有大量人(畜)活动,桃儿七生境几乎全被破坏,桃儿七被大量采挖,残存的植植株生长细弱,同其它种群相比,植株提前进入衰老状态。很多物种的遗传多样性研究结果表明,物种生境的破坏,不仅缩小了物种适宜的生存环境,而且增加了相近个体的交配机会。桃儿七在自然状况下是一种自花授粉为主的植物[3]。自花授粉往往就要导致遗传多样性的丧失。因此,对桃儿七来说,生境的破坏和以自交为主的繁育方式很可能就是其遗传多样性的降低、导致其成为稀有濒危物种的重要原因。
3.2 桃儿七种群的遗传结构应用RAPD之类显性标记揭示种群间遗传分化时,学者们倾向于将0/1矩阵视为表型数据而采用分子变异分析(AMOVA)和Shannon表型多样性指数分析。本研究采用Shannon表型多样性指数和AMOVA分析方法,分别揭示出桃儿七种群间的变异占69.06%和68.74%,两者结果相近。桃儿七种群间已出现了很强的遗传分化。据文献报道,通过同工酶和RAPD分析,远交物种的Gst为0.2,近交或自交物种为0.5[24, 25] 。本研究表明桃儿七遗传分化指数(Gst)值高于通过RAPD研究得出的一些自交物种Gst的平均值,这个结果与对桃儿七的繁殖生物学研究结果是一致的,即桃儿七是一个自交或自交占优势的物种[3]。
基因流在许多稀有植物中较低,有时甚至缺少基因流[26]。在自然状况下,桃儿七种子传播距离是很短的。通常桃儿七果实成熟后直接掉下地,经过雨水作用,就有一些种子遗留在土中,第二年春夏之际即萌发成苗;偶尔其种子由牲畜短距离在同种群内扩散,极少情形下因鸟类或人为活动在种群内或种群间传播,因此种子短距离传播是造成由桃儿七有限基因流的原因。在野外实地考察发现,桃儿七种群分布存在比较明显的破碎化,生境面积变小造成种群内个体数量减少,因此有限的基因流增大了遗传漂变效应,易造成基因频率小的等位基因丧失,使得种群间遗传分化增大,这可能是桃儿七濒危的主要原因之一。另外,Mantel测试表明遗传距离和地理距离之间没有明显的相关性。从聚类分析的结果,虽然分布于松潘县境内地理距离较近的两河口和牟尼沟种群其遗传一致度最高,遗传距离就较小;而地理距离较远的分布于北部的打西坝和分布于中南部榆林宫种群间遗传一致度最小,遗传距离最大;地理距离最远的两个种群(即最靠北的两河口种群和地理位置最靠南的鸭嘴牧场种群)间遗传距离并不是最大的,也就是说总体上并不是地理距离越远,遗传距离越大,地理距离越近,遗传距离越小。。我们分析产生这种现象的主要原因在于,桃儿七分布范围较广,可能由于种群分布的经度(介于101°E—104°E)、纬度(28°N—33°N)变化,由此造成不同种群所处位置的温度、水分、光照、土壤等生态因子发生一定程度的变化,环境变异性强,不同种群所承受的生境选择压力存在较大差异,最终导致种群间的遗传距离与地理距离可能存在较低水平上的关联性。种群间有限的基因流与种群的空间地理隔离的关系尚需进一步深入研究。
3.3 桃儿七遗传多样性的保护策略了解物种的遗传结构是进行物种保护最重要的一环,对于制定科学的保护和物种恢复策略起着极为重要的作用。通过以上RAPD标记分析,我们了解了川西地区桃儿七种群的遗传多样性和种群遗传结构状况,对四川西部地区濒危植物桃儿七提出以下保护策略:
(1)实施原位保护策略
基于RAPD标记的桃儿七遗传多样性低这一现状,可对其实施原位保护策略。在就地保护时除了对所有种群进行必要的保护外,应选择遗传多样性水平高的种群进行重点保护,如本研究中的松潘县牟尼沟(MNG)种群,其次为红原县打西坝(DXB)种群。
(2)实施迁地保护策略
基于RAPD标记的桃儿七遗传多样性主要保持在种群之间,种群间变异量接近70%,因此在桃儿七迁地保护时应尽量在较多的种群中取样,尽量保护所有现有种群。
(3)保护和重建桃儿七种群的适宜生境
桃儿七对生长环境要求特殊,建议有关部门对桃儿七较为集中的生长地采取封山或禁牧,禁止滥采乱挖等措施。只有保护好它的生境,才能保证它正常生长、繁育,从而保护其遗传多样性。
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