文章信息
- 李志萍, 张文辉, 崔豫川
- LI Zhiping, ZHANG Wenhui, CUI Yuchuan
- NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子萌发及幼苗生长的影响
- Effects of NaCl and Na2CO3 stresses on seed germination and seedling growth of Quercus variabilis
- 生态学报, 2015, 35(3): 742-751
- Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(3): 742-751
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201304190747
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文章历史
- 收稿日期:2013-04-19
- 网络出版日期:2014-04-03
土壤的盐碱化治理已成为全球范围内迫切需要解决的重大课题。近年来,人们开始由排盐工程治理转向了筛选耐盐植物的生物治理。天津位于渤海之滨,在盐碱地上开展绿化一直是困扰天津城市建设的难题。近年来,天津市滨海地区投入大量的人力、物力、财力进行园林绿化建设,但是在实施土壤改良、排盐技术处理等项目过程中有时不能达到预期效果,导致植物死亡,造成不必要的损失[1]。因此筛选具有较强耐盐碱能力的园林植物向天津引种显得尤为迫切。
栓皮栎(Quercus variabilis)是我国重要的造林树种之一,其木材、树皮、果实及叶等均有重要的经济价值;栓皮栎林是组成我国落叶阔叶林的一个基本群系,同时对保持水土、涵养水源、增加土壤肥力等方面均有重要意义[2]。将栓皮栎引种到天津地区作为园林植物栽培,不仅可以在绿化、美化环境中发挥作用,而且可以通过软木、栲胶原料生产,为地方经济发展做出贡献。目前对栓皮栎的研究内容主要集中于生物学特性、生态学特性、种群生态、资源培育以及综合利用方面[3],关于其对盐渍化土壤适应性方面实验研究很少。2008年将栓皮栎幼苗引入到天津市区,在不同干旱、盐渍化土壤上栽植,观测其园林特性,发现其对干旱、盐渍化土壤具有一定适应性[4, 5],然而关于栓皮栎种子耐盐碱方面的研究还未见报道。
种子萌发期是植物生活史中最脆弱的阶段,也是进行抗逆性研究的重要时期。近年来,国内外有关盐碱胁迫对种子萌发影响的研究越来越多[6, 7],但是缺乏统一的衡量指标,且研究多集中在NaCl胁迫,而对NaHCO3、Na2CO3胁迫涉及相对较少,在某种程度上可能脱离了植物生境的实际情况[8, 9]。由于天津地区盐渍化土壤主要由以NaCl为主的中性盐和以Na2CO3为主的碱性盐组成[10],且栓皮栎主要通过种子繁殖[11],因此研究栓皮栎种子在盐碱条件下的萌发和生长对其作为园林植物引种到天津具有重要指导意义。
本研究在控制试验条件下,模拟不同NaCl和Na2CO3胁迫条件(0、 50、 100、 200和 400 mmol/L),采用培养皿滤纸萌发的方法探讨盐碱胁迫对栓皮栎种子萌发、生长及保护酶系统等的影响,为栓皮栎种子萌发期的耐盐碱特性提供理论参考。
1 实验材料与方法 1.1 实验材料实验用种子采自栓皮栎分布中心秦岭北坡,周至县楼观台林场。2012 年10 月份采摘种子后水选法去除空粒和夹杂物,经表面阴干后加入磷化铝包装寄运回实验室,在4 ℃冰箱中保存备用。
种子大小、重量及活力的测定:1)种子千粒重的测定以1000 粒×3 组的平均值为其平均重量(±标准误差)。2)种子大小以毫米纸为标准,测定20 粒种子的长轴和短轴,求平均值。3)将种子切成薄片,80 ℃烘干至恒重,测定含水量。4)活力测定是按照国家标准GB2772-81《林木种子检验方法》,从供试样品中随机取出50 粒种子通过TTC法测定活力[12],统计数据。
经检测,实验用栓皮栎种子直径(15.59±2.23) mm,长(21.07±1.43) mm,千粒重(3720±109) g。新鲜栓皮栎种子含水量为75.51%,种子活力在90%以上。选取饱满、大小均匀的种子备用。
1.2 种子培养及胁迫处理(1)根据预实验以及相关文献[13, 14, 15]配制溶液
NaCl溶液:用NaCl配成Na+浓度依次为50,100,200,400 mmol/L的溶液,相应pH值均为6.6(用 NaOH溶液调配);
Na2CO3溶液:用Na2CO3配成Na+浓度分别为50,100,200,400 mmol/L的溶液,相应pH值为8.9,11.6,11.8 和11.9。
(2)2012 年12 月15 日开始种子萌发胁迫实验
选取大小均一、成熟饱满的栓皮栎种子,用自来水冲干净,经0.1%HgCl2消毒10 min,蒸馏水冲洗3 次。吸水纸吸干种子表面水分后,将种子播种于置入2 层纱布和1 层滤纸的培养皿(直径12 cm)中,每一发芽床摆放20 粒种子。实验设NaCl和Na2CO3 2 个处理,每个处理4 个梯度水平,每个水平3 次重复。NaCl处理下每皿分别移入10 mL不同浓度的NaCl溶液,Na2CO3处理分别移入10 mL不同浓度Na2CO3溶液,使滤纸饱和,用蒸馏水作对照。盖上玻璃盖,以防止溶液蒸发,2d更换1次发芽床。将培养皿置于SPX-150B-Z型生化培养箱内,恒温25 ℃,相对湿度60%,连续黑暗培养10 d。
1.3 指标测定 1.3.1 生长指标测定以种子露白作为发芽标志,每天定时观察、记录种子萌发数,测量胚根长度。种子萌发的时限按国际种子检验规程规定发芽天数为10 d[16]。由于10 d之内并未出现胚轴及子叶,发芽结束后测定全部胚根鲜重:
式中,n为萌发种子数,N为供试种子数[17]。
式中,Gt为时间t日的萌发数,Dt为相应的萌发天数。
式中,s为胚根鲜重[18]。
式中,L指每一皿中全部萌发种子胚根或胚轴长度的总和;Ni指第i天的萌发种子数; Dt指实验持续的天数(10 d),Di 指第i天[19]。
式中,VIv盐为盐胁迫下的萌发活力指数,VIv水为对照下的萌发活力指数[20]。
相对盐害率[9]
耐盐临界值:先对相应指标和Na+胁迫浓度进行相关分析,若两者存在相关性,则进行回归分析,根据回归方程求出耐盐临界值。耐盐临界值为与盐碱胁迫强度呈正相关的指标增加到对照的200%时所对应的浓度,或者与盐碱胁迫强度呈负相关的指标降低到对照的50%时所对应的浓度[21]。
1.3.2 生理指标测定保护酶酶液的提取:待发芽结束后,取每培养皿中发芽种子的胚根0.1 g,置于预冷的研钵中,加适量预冷的50 mmol/L磷酸缓冲液(含1% 聚乙烯吡咯烷酮,pH值 7)及少量石英砂,在冰浴中研磨成匀浆,在2—4 ℃下,12000 r/min离心20 min。上清液为酶液。
SOD(superoxide dismutase)的测定参照李合生[22]的方法,以抑制氯化硝基四氮唑蓝光化还原50%为一个酶活性单位表示。CAT(catalase)的测定用紫外吸收法,以1 min内A240减少0.1的酶量为一个酶活性单位[23]。POD(peroxidase)的测定用愈创木酚染色法,以每1 min内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位[24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]。可溶性蛋白含量采用考马斯亮兰染色法[22]测定。
丙二醛和可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸法测定[26]:取每培养皿发芽种子胚根0.1 g,加入10% TCA(三氯乙酸)迅速研磨,离心后,取上清和10%TCA各2 mL于另一空离心管中,加盖煮沸15 min,冷却后再次离心,测定吸光值。脯氨酸含量测定:取每培养皿发芽种子胚根0.1 g,加入3%磺基水杨酸溶液研磨,将匀浆液全部转入到离心管中,沸水浴10 min,冷却离心后吸取上清液即为脯氨酸的提取液,采用茚三酮显色法[22]测定含量。
1.4 数据分析方法所得数据用SPSS17.0进行单因素方差分析,并在置信水平95%上用Duncan方法进行多重比较,每一指标的图或表均为3次重复求平均值,然后利用Excel2003绘制而成。
2 实验结果与分析 2.1 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子萌发的影响 2.1.1 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子总萌发率的影响不同字母表示相同处理不同Na+浓度在P<0.05水平上差异显著如图 1所示,胁迫结束(10 d)后,两种处理下的萌发率均呈现波动趋势。对照的萌发率为75%,50和200 mmol/L Na+浓度下,NaCl和Na2CO3胁迫处理的萌发率均高于对照,且50 mmol/L NaCl胁迫下萌发率达到最大值(85%);100和400 mmol/L浓度下两者的萌发率均低于对照,在100 mmol/L Na2CO3胁迫下,萌发率达到最低(62%)。进行单因素方差分析后发现,两种处理对种子萌发率均没有显著影响。除对照之外,相同Na+浓度条件下,NaCl的萌发率总是高于Na2CO3,说明Na2CO3对种子发芽的影响较NaCl高。
2.1.2 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子发芽指数的影响发芽指数综合种子萌发的数目、速度以及整齐度3个因素,比单纯的发芽率更能全面地反映种子的萌发情况[27]。如图 2所示,50和100 mmol/L NaCl处理下种子的发芽指数分别是对照的1.08和1.05倍,之后随着处理浓度的升高发芽指数降低,400 mmol/L时只降到对照的93.7%。而在Na2CO3胁迫下,各处理浓度的发芽指数呈波动趋势且均低于对照。100 mmol/L处理下达到最低值,仅为对照的72.2%;200 mmol/L处理下达到对照的96.0%。进行单因素方差分析后发现,两种处理对种子发芽指数均没有显著影响。相同Na+浓度条件下,NaCl的发芽指数总是高于Na2CO3,说明Na2CO3对种子的伤害较NaCl高,导致种子萌发数目及速度均受到较大影响。
2.2 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子生长的影响 2.2.1 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子胚根生长的影响种子萌发后,胚根的延伸可以反映出植物定居成苗的特性。从表 1中可以看出,胁迫结束(10 d)后,NaCl处理下胚根长度、胚根生长速率和胚根鲜重均随Na+浓度增加呈下降趋势,在400 mmol/L浓度时下降到最低,分别为对照的45.4%、44.4%、30.6%,且与对照差异显著。Na2CO3胁迫下胚根长度、胚根生长速率和胚根鲜重呈波动下降趋势,且均低于对照,400 mmol/L Na2CO3胁迫下分别下降为对照的32.6%、41.7%、23.4%。相同Na+浓度条件下,NaCl处理下的胚根长度、胚根生长速率和胚根鲜重均大于Na2CO3,说明Na2CO3胁迫对种子胚根生长的影响更为严重。与对照相比,400 mmol/L NaCl胁迫下栓皮栎种子生长受到抑制,且胚根尖端变黑;而在同浓度Na2CO3胁迫下不仅胚根尖端变黑,种子本身也明显发黑(图 3)。
Na+浓度 Na+Concentration/ (mmol/L) | 胚根长度 Length of radicle/mm | 胚根生长速率 Radicle growth rate/(mm/d) | 胚根鲜重 Fresh weight of radicle/mg | |||
NaCl | Na2CO3 | NaCl | Na2CO3 | NaCl | Na2CO3 | |
0 | 28.9±4.8a | 28.9±4.8a | 1.08±0.011a | 1.08±0.011a | 295.0±0.02a | 295.0±0.02a |
50 | 24.8±1.2ab | 17.5±0.5b | 0.92±0.023ab | 0.70±0.005b | 282.4±0.25ab | 112.8±0.26b |
100 | 23.4±3.4ab | 14.2±3.8bc | 0.90±0.012ab | 0.58±0.017bc | 265.9±0.35ab | 78.6±0.25bc |
200 | 17.5±3.0c | 18.7±4.4ab | 0.67±0.007bc | 0.68±0.010b | 189.0±0.09bc | 85.6±0.19b |
400 | 14.2±0.8c | 10.2±0.9c | 0.48±0.009c | 0.45±0.005c | 90.4±0.38c | 69.1±0.24c |
通过相关分析及建立盐碱胁迫浓度与各指标之间的回归方程,发现栓皮栎种子胚根鲜重、胚根长度、胚根生长速率与盐碱胁迫具有显著相关关系,且NaCl胁迫下胚根鲜重、胚根长度和胚根生长速率的临界值分别为300.0、333.6、369.6 mmol/L;Na2CO3胁迫下其临界值分别为67.2、182.0、187.5 mmol/L(表 2)。
测定指标 Index | 胁迫处理 Treatment | 回归方程 Regression equation | 相关系数 Correlation index (R2) | 临界值 Critical value/ (mmol/L) |
胚根长度 | NaCl | y = 9×10-5x2-0.0732x + 28.903 | 0.990 | 333.6 |
Length of raticle | Na2CO3 | y = 0.0001x2-0.0756x + 24.897 | 0.629 | 182.0 |
胚根生长速率 | NaCl | y = 2×10-7x2-0.0002x + 0.1074 | 0.984 | 369.6 |
Radicle growth rate | Na2CO3 | y = 4×10-7x2- 0.0003x + 0.0961 | 0.709 | 187.5 |
活力指数 | NaCl | y = -5×10-5x2-0.051x + 36.369 | 0.927 | 300.0 |
Vigor index | Na2CO3 | y = 0.0004x2-0.1932x + 27.969 | 0.777 | 69.0 |
胚根鲜重 | NaCl | y = -0.0001x2-0.485x + 302.71 | 0.987 | 300.0 |
Fresh weight of radicle | Na2CO3 | y = 0.0031x2-1.6688x + 245.67 | 0.745 | 67.2 |
种子活力比常规发芽率的测定更能反映种子在实际条件下萌发速度和整齐度以及幼苗健壮生长的潜势[28]。如图 4所示,NaCl胁迫下种子的活力指数在50 mmol/L时达到最大值,是对照的1.17倍。100—400 mmol/L浓度下活力指数不断下降,400 mmol/L时下降到最低,与对照差异显著。而在Na2CO3处理下种子活力指数均低于对照,且差异显著,400 mmol/L下降到最低值,仅为对照的19.3%。相同Na+浓度条件下,NaCl的活力指数总是高于Na2CO3,说明Na2CO3处理对种子活力的抑制作用大于NaCl。建立两种胁迫条件下活力指数与Na+浓度的回归方程,发现其在NaCl和Na2CO3胁迫下的临界值分别为300.0、69.0 mmol/L(表 2)。
2.2.3 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子耐盐指数和相对盐害率的影响相对盐害率反映栓皮栎种子受胁迫的伤害程度,耐盐指数反映其对盐碱胁迫的耐受程度。从表 3中看出,NaCl胁迫下,400 mmol/L时相对盐害率达到最大值,而在50和200 mmol/L下的种子并未受到毒害,反而表现为萌发受到促进;Na2CO3处理下,100 mmol/L时相对盐害率达到最大,而50 mmol/L下表现为促进。NaCl胁迫下种子的耐盐指数在50 mmol/L处理下达到最大值,是对照的1.17倍。100—400 mmol/L浓度下耐盐指数不断下降,在400 mmol/L下降到最低,且与对照差异显著。而在Na2CO3处理下种子耐盐指数均低于对照,400 mmol/L下降到最低值,仅为对照的19.3%。相同Na+浓度条件下,NaCl的耐盐指数和相对盐害率总是高于Na2CO3,说明Na2CO3处理对种子活力的毒害作用大于NaCl。
Na+浓度 Na+ concentration/ (mmol/L) | 耐盐指数 Salt tolerance index | 相对盐害率 Relative salt-harmed rate | ||
NaCl | Na2CO3 | NaCl | Na2CO3 | |
0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
50 | 116.82 | 42.07 | -13.33 | -2.67 |
100 | 92.47 | 22.96 | 2.22 | 17.33 |
200 | 66.82 | 27.85 | -8.89 | 0 |
400 | 26.04 | 19.01 | 8.89 | 13.33 |
在植物抗逆性实验中,通常用丙二醛(MDA)的含量变化来衡量脂质过氧化程度[29]。随Na+浓度的升高,两种处理下的MDA含量均呈现升高趋势,但升高幅度不同,且Na2CO3胁迫下的MDA含量均高于NaCl(图 5),可见Na2CO3胁迫下栓皮栎种子的膜脂过氧化程度较大。
在NaCl胁迫下,SOD活性在50—200 mmol/L时均高于对照,但与对照无显著差异,而400 mmol/L时显著低于对照。在Na2CO3胁迫下,SOD活性均低于对照(图 6),且与对照差异显著。NaCl处理下的SOD活性是相同浓度Na2CO3处理的1.01—1.03倍,说明SOD对碱胁迫较敏感。
两种处理下POD活性均呈现波动趋势,且彼此间均无显著影响(图 6)。等Na+浓度下,Na2CO3处理下的POD活性均高于NaCl,说明NaCl对POD活性的抑制程度大于Na2CO3。
CAT活性在NaCl和Na2CO3胁迫下均呈现先降低后升高的趋势。两种处理下的CAT活性均在50 mmol/L下达到最低值,分别为对照的76.8%、93.1%,之后不断升高,NaCl处理在400 mmol/L 时达到最大值,Na2CO3胁迫在200 mmol/L时达到最大值(图 6)。等Na+浓度下,Na2CO3处理下的CAT活性均高于NaCl,说明CAT活性对盐胁迫敏感度低于碱胁迫。
2.3.2 NaCl和Na2CO3胁迫对栓皮栎种子有机渗透调节物质的影响可溶性蛋白含量在两种胁迫下均呈现升高趋势,在400 mmol/L时达到最大值,分别比对照增加33.1%、68.5%(图 7)。Na2CO3处理下的可溶性蛋白含量是相同浓度NaCl处理的1.26—1.88倍,说明碱胁迫下栓皮栎种子受到更大的渗透胁迫。
0 —200 mmol/L NaCl胁迫条件下,脯氨酸含量基本保持不变,400 mmol/L时迅速增加到对照的1.18倍。Na2CO3处理下的脯氨酸含量曲折上升,在0—200 mmol/L时均高于同浓度NaCl处理,200 mmol/L时达到最大值,400 mmol/L时有所下降,且低于同浓度NaCl(图 7)。可见,脯氨酸对Na2CO3和高浓度(400 mmol/L)NaCl处理较为敏感。
可溶性糖在不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫下呈现曲折升高的趋势。两种处理分别在400 mmol/L和100 mmol/L时达到峰值,分别为对照的1.68、2.18倍(图 7)。同等Na+浓度下,Na2CO3处理下的可溶性糖含量均高于NaCl,说明碱胁迫下栓皮栎需要更多的可溶性糖来调节渗透压。
3 讨论50 mmol/L NaCl处理下种子的萌发率、活力指数和耐盐指数均比对照高,相对盐害率表现为促进作用,这与邱念伟等[30]对伽蓝菜和碱蓬、毛培春等人[20, 31, 32]的研究结果相似,可能与低浓度盐促进细胞膜渗透调节有关,也可能是微量的Na+对呼吸酶有一定的激活作用[33]。即使盐碱浓度较高(200 mmol/L),种子萌发率仍高于对照,可能是栓皮栎种子较大,其本身具有较高的含水量引起的。Na2CO3胁迫下,种子发芽指数均受到抑制,而200 mmol/L 条件下发芽指数较高,可能此时脯氨酸和可溶性蛋白含量增加、CAT活性增强,使种子发芽受抑制程度降低,或者是Na+、Cl-参与了无机渗透调节[34],这有待于进一步研究。等Na+浓度时,Na2CO3胁迫下萌发率、发芽指数、活力指数和耐盐指数均小于NaCl,说明碱胁迫比盐胁迫具有更大的伤害力[35, 36]。
NaCl胁迫条件下的胚根生长和胚根生长速率受到抑制,即随着Na+浓度的增加而显著下降;Na2CO3胁迫下胚根生长严重受阻,这可能和细胞内激素调节有关[37],200 mmol/L胁迫条件下却高于100 mmol/L,可能较高且适宜的浓度胁迫仍然对种子生长有刺激作用,这与窦声云等[38]对老芒麦的研究结果类似。50 mmol/L NaCl处理下的胚根鲜重高于对照,可能较低浓度的胁迫可以刺激同化物更多向根系分配,促使根系的分枝和下扎[39]。Na+浓度相同时,Na2CO3胁迫下的胚根长度、胚根生长速率、胚根鲜重均低于NaCl胁迫,因为碱性盐胁迫下除了Na+作用外还增加高pH的作用[40]。
根据耐盐临界值的比较分析可以发现,活力指数和胚根鲜重对盐胁迫较为敏感,其次为胚根长度,胚根生长速率最不敏感。由于胚根鲜重受到最为强烈的抑制,因此,由胚根长度得到的耐盐临界值(最小耐盐临界值)最能反映种子萌发期的耐盐性,在盐碱胁迫下其最小临界值分别为333.6、182.0 mmol/L。
在胁迫条件下,植物因盐碱伤害而使细胞膜受到损伤,产生大量的MDA,膜受伤害又产生大量自由基[41];此时植物的保护酶系统被激活。SOD、POD和CAT是植物体内酶促防御系统的3个重要保护酶,它们发挥协同作用,消除活性氧,保护植物膜系统[42]。本研究中,栓皮栎种子在低浓度NaCl(50 mmol/L)胁迫下,主要是SOD起作用,这与寇贺等[43]对大豆(Glycine max)种子萌发的研究结果相似;而在Na2CO3和高浓度NaCl胁迫下SOD活性降低,可能是其调节能力有限,酶结构遭受破坏导致体内积累了过量的活性氧氧自由基,这些自由基又引起膜过氧化,产生大量MDA。CAT和POD在两种胁迫下并未受到伤害导致活性降低,而是在波动范围内保持正常活性来清除氧自由基。等Na+浓度,NaCl处理下的SOD活性均高于Na2CO3,Na2CO3处理下的POD和CAT活性均高于NaCl。由此推测NaCl处理下主要靠SOD清除自由基,Na2CO3处理下主要靠POD和CAT活性来维持植物体内活性氧的产生和清除之间的动态平衡,可能是栓皮栎种子保护酶活性在盐碱胁迫下的调控机制不同,这有待于进一步研究。
在盐碱胁迫下,细胞会发生渗透胁迫,植物通过增加体内有机渗透调节物质含量来降低细胞内渗透势,提高自身耐受性。本研究中,两种处理下的可溶性蛋白含量均上升,可能栓皮栎种子经盐碱胁迫后产生较多的有害物质,需要合成较多的酶类物质以清除这些有害物质[13]。在高浓度NaCl(400 mmol/L)胁迫下脯氨酸含量的显著增加,可降低细胞渗透势,缓解渗透胁迫对植物生长的抑制作用;而在Na2CO3胁迫下增幅不显著,可能是Na2CO3抑制了脯氨酸合成酶系[44]。两种胁迫下可溶性糖含量均升高,其含量增加可提高植物细胞的渗透调节能力。等Na+浓度下,Na2CO3处理下的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均高于NaCl。这是由于植物在碱胁迫下除了要承受与盐胁迫相同的渗透胁迫与离子伤害,还要抵御高pH值胁迫。已经有研究表明,以Na2CO3为主要盐分的碱胁迫对植物生长发育的危害远大于NaCl为主的盐胁迫[45, 46, 47],在本研究中也得到了证实。
综上所述,在盐碱胁迫下,栓皮栎种子通过提高自身保护酶活性、增加体内渗透调节物质等来抵抗逆境,降低盐碱胁迫对种子萌发及生长的伤害。可见,栓皮栎在种子萌发期具有一定的抗盐碱能力,但本研究不能完全代表大田育苗的实际情况,还有待于进一步进行大田出苗期耐盐碱实验,使其在天津等盐碱地区大面积广泛种植。
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