自20世纪中叶以来，地面O₃浓度不断升高，已经导致全球许多地区的冬小麦产量显著下降^{[1, 2, 3, 4]}。高浓度O₃可导致冬小麦小麦穗长、千粒重、粒重和穗粒数明显降低^{[5, 6]}。籽粒灌浆期缩短、灌浆物质来源不足、库容变小、充实度降低、粒重变小是高浓度O₃条件下小麦籽粒产量下降的主要原因^{[6, 7]}。所有影响最终产量的因素，都是通过源/库系统的变化来调节的。高浓度O₃会严重损伤冬小麦叶片，降低其对单茎产量的贡献率，同时使得非叶绿色器官的贡献率均呈上升趋势^[8]。

小麦籽粒果皮的绿色层具有较强的光合能力，对籽粒最终淀粉含量的贡献约为2%^{[9, 10, 11]}。过去研究高浓度O₃对冬小麦生长和生产的影响时，较少考虑到籽粒自身的健康状况和干物质累积的具体过程^{[7, 11, 12, 13]}。因此，本文通过开顶式熏气室(OTC)对冬小麦进行O₃胁迫处理，用IMAGING-PAM调制荧光仪测量了籽粒发育过程中果皮的光合能力，结合单位质量籽粒光合色素含量和籽粒干物质累积情况，深入分析了高浓度O₃对冬小麦籽粒发育和产量形成的影响，为全面评估高浓度O₃对冬小麦生产的影响提供依据。

试验于2008年10月至2009年7月在中国气象局固城生态与农业气象综合试验站(39°08′N，115°40′E，海拔高度15.2m)进行。实验区位于华北平原北部高产农业区，属暖温带大陆性季风气候，冬小麦生育期内降水量为150mm，地下水位低于20m。试验区主要作物为冬小麦和夏玉米，土壤以潮土和砂壤土为主，0—30cm平均全氮0.98g/kg、，全磷1.02 g/kg、，全钾17.26 g/kg、。

试验所用冬小麦为中国农业科学院培育的丰抗13号(Triticum aestivum L.Feng Kang 13)。于2008年10月17日条播，行距25cm，播种量为285kg/hm²。气室周围也按照相同方式播种及施肥。水肥管理与当地种植习惯一致，冬小麦未受到病虫害及杂草的影响。小麦生育期由实验站专业人员观测。2009年5月5日全部进入灌浆期，6月4—13日收获完毕。

试验所用OTC由“中国气象科学研究院生态环境与农业气象研究所”于2008年设计建造。气室主体为八边形柱体，由镀锌钢管框架和高透光石英玻璃室壁组成，柱体高2.5 m，各边长1.5 m左右，顶部设有1个高0.50 m，与水平面成45°角的锥型台体。气室与气室之间相距3.5 m，东西向布置。气室底部设有紧贴室壁的八边形布气管，布气管外径160 mm，壁厚3.5 mm，管上交错分布着两行孔径13 mm、相距10cm(同行)的布气孔，其中1行沿水平方向布置，另一行斜向上与水平面成45°角；在气室中线两侧增加两根直径75 mm、相距75 cm的东西向布气管，管上沿水平和垂直方向分布着4行布气孔。气室地下部分为混凝土浇铸而成的八边形基座，基座深入地下2m做防渗处理。

试验设活性碳过滤空气(CF，4—28 nL/L)、不通风(5H，15—68 nL/L)、自然空气(NF，7—78 nL/L)、100 nL/L O₃ (CF100，96—108 nL/L)和150nL/L O₃ (CF150，145—160nL/L) 等5种处理水平，每个处理水平3个重复，其AOT₄₀分别为0、3264、3808、32096和60928nL L^-1 h^-1。监测结果显示，试验地O₃浓度(9:00—17:00)为7—75 nL/L，8h平均O₃浓度为45.60nL/L。浓度100nL/L和150nL/L具有特别的意义，大致为农田本底浓度的2倍和3倍，也是一般所认为的O₃对作物伤害阈值(美国SUM06的60 nL/L和世界卫生组织(WHO)AOT₄₀的40 nL/L)的2—3倍^{[14, 15]}。2009年3月17日(返青期)开始熏气，雨雪天除外，至6月2日CF100和CF150黄熟为止，共熏气67d，每天熏气8h(9:00—17:00)。

O₃发生器(CF-YG5,北京山美水美环保高科技有限公司)产生的O₃与活性炭过滤后的清洁空气混匀后通过布气管路输入气室。采用流量计对O₃浓度进行调节，用BF-8810型O₃分析仪(北京北分瑞利分析仪器有限责任公司)连续监测气室内的O₃浓度，并根据测定结果，毎3h对CF100和CF150的O₃浓度进行一次调节。

于5月13日18:00开始，在水下将冬小麦穗剪下带回室内^[16]。将籽粒用双面胶贴在硫酸纸上(3行×4列)，放到浸水后的黑色海绵下进行30min的暗适应。然后用IMAGING-PAM (H. Walz,Effeltrich,Germany)调制荧光仪(Mini探头)测量暗适应后的最小荧光产额F_o和最大荧光产额F_m，间隔1min后打开活化光(297μmol m^-2 s^-1)诱导光合作用(诱导6min)，每隔30s测量1次实时荧光F_t和光下最大荧光F_m′。测量诱导曲线后2min后测量快速光曲线(rapid light curve,RLC)：在0—922μmol m^-2 s^-1间设置18个梯度，相邻梯度间隔10s(图 1)。

图 1 自然空气组扬花后第16天籽粒果皮PSⅡ的实际光化学效率 (PAR为165μmol m-2 s-1) Fig. 1 Quantum yield of photochemical energy conversion in PSⅡ in grain pericarp under 165μmol m-2 s-1 PAR in the 16th day after anthesis of ambiant air treatment

图选项

用P=P_m·α·PAR/sqrt(P_m²+(α·PAR)²)对光合电子传递速率(ETR)进行拟合，式中P_m为最大光合电子传递速率，PAR为光合有效辐射，α是快速光曲线的初始斜率，P_m/α为半饱和光强^[17]。F_o、F_m、PSⅡ的最大光量子产额F_v/F_m等参数由仪器输出^{[18, 19, 20]}。

(1)干物质累积

于每个处理组的扬花期，标记出有代表性的500穗，自开花后第4天(各处理组开花时间不一致，CF100、CF150和5H均晚于NF，分别于扬花后第4天开始试验)起，每次随机选取15穗(分3组)，剥出籽粒后测量鲜重和干物重(105℃杀青40min，70℃烘干至恒重)，然后计算千粒干物重和籽粒含水率。以上测量毎2d进行1次。

(2)灌浆速率

用Logistic方程y=K/(1+ a·e^-bt)对千粒干物重进行拟合，以开花后天数(t)为自变量，千粒干物重(y)为因变量，式中K为理论最大千粒重，a、b为待定系数^[21]。由Logistic方程的一阶和二阶导数可得出以下参数：最大灌浆速率V_max，V_max对应的时间T_max；灌浆高峰开始时间t₁，灌浆高峰结束时间t₂，灌浆高峰结束前的平均灌浆速率V_t2^[21]。以y达到K的99%为灌浆终止时间，可得出灌浆持续时间t₃，进而得出整个灌浆期的平均灌浆速率V_mean^[21]。

(3)光合色素

自开花后第6天开始，每组随机选取已标记好的、大小相近的5穗，剥出籽粒混匀后，称取1g籽粒并用乙醇法测量叶绿素与类胡萝卜素含量(3个重复)^[22]。

(4)籽粒形态

收获后，每个处理水平随机选取100粒，用游标卡尺测量籽粒的长度、最大宽度和最大厚度。然后随机选取200粒，平均分为20组，用排水法(半微量滴定管)测量籽粒体积。擦干后称量各组重量并计算籽粒密度^[23]。

(5)穗粒数和穗粒重

收获后，每个处理水平选取有代表性的100穗统计穗粒数并称量穗粒重。

用Origin8.0进行曲线拟合；用SPSS16.0进行数据统计与差异分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著；用多元线性回归的标准化系数判定不同影响因素的主次。

灌浆过程中籽粒光合色素与类胡萝卜素含量的变化情况如图 2所示。叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量具有相似的变化规律(图 2)，CF、NF和CF100均由最大值逐渐下降，5H和CF150先从一个较低水平迅速上升再逐渐下降；CF100和CF150在扬花后的8—16d内显著高于CF与NF；扬花16d后迅速下降，20d后显著低于其余3组(P＜0.01)。由图 2可见，扬花后8—14d内类胡萝卜素含量的变化较为平稳，第14d后迅速下降。

图 2 O3胁迫对籽粒光合色素和类胡萝卜素含量的影响 Fig. 2 Effects of O3 stress on photosynthetic pigments and carotenoid content of developing grains CF: 活性炭过滤空气，5H: 不通风，NF: 环境空气，CF100: 100 nL/L O3，CF150: 150 nL/L O3; 图中数据为mean±SD， n =3

图选项

由图 3可见，各组PSⅡ的最大光量子效率(F_v/F_m)、最大光合电子传递速率(P_m)以及半饱和光强 (P_m/α) 均在扬花后第10天达到最大值。由图 3可见，CF100的F_v/F_m在扬花后第10天和13天显著低于NF，第7天和23天显著高于NF；CF150在扬花后第7天、16天和23天显著低于NF，第19天显著高于NF。CF100和CF150的P_m与P_m/α均在扬花后第7天、19天和23天显著低于NF；P_m均在第13天显著高于NF。CF100快速光曲线的初始斜率(α)在扬花后第13天和19天显著高于NF；CF150在第7天和13天显著高于NF，在第16天和23天显著低于NF(图 3)。综上所述，高浓度O₃在灌浆初期和后期对籽粒果皮的光合能力有一定抑制作用，在灌浆中期显著提高了果皮绿色层的光合能力。

图 3 O3O3胁迫对冬小麦籽粒果皮 PSⅡ最大光量子产额和快速光响应能力的影响 Fig. 3 Effects of O3 stress on potential quantum yield of PSⅡ (Fv/Fm) and the capacity of rapid light response in the pericarp of winter-wheat grains 图中数据为mean±SD， n =72，图形上方小写字母不同表示差异显著

图选项

千粒干物重的变化情况见图 4所示，CF100和CF150在整个灌浆过程中均显著低于NF；CF与NF高度一致；扬花24d后，5H迅速上升，最终与NF处于同一水平。收获时，CF100和CF150的千粒干物重分别比NF下降了10.7%和17.8%(均为P＜0.01)。籽粒含水率的变化情况如图 4所示，5H的含水率始终高于其余4组；CF100和CF150在扬花后26d迅速下降，其余3组在扬花后32d才快速下降；收获时，籽粒含水量均处于20%左右。

图 4 O3胁迫对冬小麦籽粒干物质累积与含水率的影响 Fig. 4 Effects of O3 stress on dry matter accumulation and water content of winter-wheat grains 图中数据为mean±SD， n =72，图形上方小写字母不同表示差异显著

图选项

扬花后4—18d内，NF的灌浆速率显著高于CF100和CF150，5H的灌浆速率与CF100高度一致；扬花18d之后，CF100的灌浆速率迅速下降，扬花24d后略低于CF150；灌浆高峰出现后，5H的灌浆速率下降较慢，扬花24d后显著高于NF(图 5)。扬花26d后，NF的灌浆速率已下降到CF100和CF150之下(P＞0.05)。

图 5 O3胁迫对冬小麦灌浆速率的影响 Fig. 5 Effects of O3 stress on grain filling rate of winter-wheat grains 图中数据为mean±SD， n =3

图选项

与NF相比，CF100的扬花期延迟了2d，CF150延迟了3d(表 1)。NF的理论最大千粒干物重(K)和最大灌浆速率(V_max)均显著高于CF100和CF150，整个灌浆过程的平均灌浆速率(V_mean)比CF100低1.1%(P＞0.05)，比CF150高2.3%(P＜0.05)。CF150和5H的最大灌浆速率出现时间、灌浆高峰开始时间和灌浆高峰结束时间均显著晚于NF。CF100和CF150灌浆高峰结束前的平均灌浆速率(V_t2)、灌浆持续时间(t₃)较NF分别下降了9.3%和14.7%、11.5%和15.3%。

与NF相比，CF100和CF150处理下籽粒的长度、最大宽度、最大厚度和体积的变化分别为-8.3%和-8.9%、-6.9%和-11.3%、-6.3%和-9.5%、-9.7%和-24.3%(P＜0.01)，差异均达到显著水平(表 2)。此外，CF150的厚度显著低于CF100；5H的宽度和体积显著高于另外4组。CF100和CF150的粒数分别较NF下降5.6%(P＞0.05)和13.9%(P＜0.05)。与NF相比，CF、5H、CF100、CF150的粒重变化依次为3.1%( P＞0.05)、13.3%(P＜0.05)、-16.0%(P＜0.01)、-33.8%(P＜0.01)。

多元线性回归结果表明，粒重影响因素的重要性依次为体积、灌浆持续时间(t₃)、灌浆高峰结束前的平均灌浆速率(V_t2)。体积影响因素的重要性依次为最大宽度、最大厚度和长度。

作物对CO₂的同化及同化物向籽粒运输、分配和积累是决定作物产量的两个关键过程。在库的准备阶段，源是限制因素，在经济产量的决定阶段，库起主要限制作用；当源受到外界环境限制时，其限制将居于主导地位^[24]。研究表明，高浓度O₃对冬小麦的源和库的发育与功能均有明显的抑制^{[2, 5, 6, 7]}。随着小麦颖果生长，果皮内侧发育出一层富含叶绿体与叶绿素的绿色组织，该绿色层细胞在弱光条件下仍能进行正常的光合作用并迅速将光合产物输送到内部胚珠，对籽粒淀粉干重的贡献率约为2%，为籽粒的营养来源与生长发育增添了一个复杂因素^{[9, 25, 26]}。

早期的颖果果皮肥厚，外表皮为乳白色，内表皮一侧呈浅绿色(仅含2—3层绿色细胞)^[27]。扬花6d后，CF150和5H的单位质量籽粒光合色素含量显著低于其余3组，是其生育进程延迟(表 1)、绿色层未充分发育的结果。籽粒生长中期(长度为终长的1/2—2/3时)是果皮绿色层生长最旺盛的阶段，细胞数量和体积明显增加，叶绿体数量与叶绿素含量均显著高于旗叶^{[10, 27]}。扬花后9—11d内籽粒的长度增加很快，末期可达最大长度的3/4，但厚度和干重增长缓慢，含水量在70%以上^[28]。以上论述与图 1中单位质量籽粒的叶绿素含量在扬花后6—8d达到最大值相符。籽粒长度达到终长的3/4并接近膨大完成时，子房壁明显变薄，绿色层也变得松散，部分叶绿体衰退瓦解，基粒减少，片层结构紊乱或散失，有些叶绿体已被淀粉粒充满^[27]。扬花8d后单位质量籽粒果皮叶绿素含量持续下降，以及8—14d内籽粒干物重增长迅速而类胡萝卜素含量变化平缓，既是籽粒干物质累积的结果，也是果皮是叶绿体衰老(类胡萝卜素含量增加)的结果。灌浆高峰期开始至最大灌浆速率出现期间(扬花后8—16d)，CF100和CF150单位质量籽粒的叶绿素含量显著高于NF，果皮绿色层对产量形成的影响也应大于NF。这与高浓度O₃下小麦叶片对单茎产量的贡献率降低，非叶绿色器官(源)的贡献率均呈上升趋势的结论一致^[8]。

尽管果皮绿色层被数层细胞和组织包裹，但仍能够接受到1/8—1/4的自然光照；离体绿色层的叶绿体数量、叶绿素含量与光合放氧速率均显著高于旗叶^{[10, 27]}。果皮绿色层在特殊的生态条件下发育并执行其功能，其光合作用以C₄途径为主^{[27, 29]}。在灌浆初期，颖片、稃片和表皮透明层(无气孔)等组织限制了胚乳及果皮绿色层与外界的气体交换，绿色层可以充分吸收胚乳等内部组织呼吸释放的CO₂，并为内部组织提供所需的O₂，除了直接向胚乳输出淀粉外，对胚乳将糖分转化为淀粉以及蛋白质合成等耗能过程具有重要意义^{[11, 30]}。本试验结果表明，CF100和CF150果皮绿色层的最大光合能力在灌浆初期和后期显著低于NF，在灌浆高峰开始至峰值出现时段内显著高于NF(与单位质量籽粒叶绿素含量的差异情况一致)。显然，高浓度O₃下籽粒果皮的最大光合能力在灌浆初期受到一定抑制，在灌浆中期表现出较好的适应性，在中后期由于籽粒发育进程快于NF，果皮衰老而迅速下降。

高浓度O₃显著降低了籽粒的几何尺度与穗粒数，导致库强大幅下降(表 2)。CF100和CF150灌浆高峰结束前的平均灌浆速率(V_t2) 和灌浆持续时间(t₃与最大千粒重K显著正相关，r²=0.956，P=0.003)显著低于NF，可见，灌浆高峰结束前(t₂)灌浆速率降低、灌浆持续时间缩短(t₂后植株迅速衰老)是千粒重下降的主要原因。

籽粒在胚乳核具有生命活动时主要累积蛋白质，核解体后(扬花后半个月左右)才大量合成并累积淀粉^[28]。籽粒中小分子的糖向淀粉转化，氨基酸向蛋白质转化都要消耗一定的能量(ATP)^[28]。在灌浆高峰开始至峰值出现时段内，CF100和CF150单位质量籽粒叶绿素含量(图 1)和果皮绿色层最大光合能力(图 2)均显著高于NF，可为胚乳呼吸代谢提供更多的O₂，从而促进蛋白质的合成与累积。这可能是籽粒中谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)活性下降而籽粒蛋白质浓度反而上升的原因^{[7, 12]}。当籽粒进入以淀粉累积为主的阶段后，CF100和CF150的籽粒果皮已经衰老(扬花19d后)，单位质量籽粒叶绿素含量与果皮绿色层光合潜力均显著下降，难以为小分子的糖向淀粉转化提供足够的能量，且后期籽粒迅速衰老，也缩短了淀粉累积时间^{[11, 28]}。高浓度O₃可导致籽粒中直链淀粉、破碎淀粉含量上升，支链淀粉和总淀粉含量下降，蛋白质和氨基酸含量大幅增加，果皮绿色层在其中扮演着独特而重要的角色^{[31, 32]}。结合叶绿素含量与最大光合能力的变化情况可见，CF100和CF150果皮绿色层对籽粒淀粉与蛋白质累积等耗能过程的影响要大于NF。

(1) 高浓度O₃显著降低了籽粒的几何尺度与粒数，籽粒体积缩小对粒重的影响大于粒数下降。

(2) 高浓度O₃在灌浆前期延缓了冬小麦的生育进度，在灌浆后期使得植株迅速衰老，灌浆持续时间大幅缩短。

(3) 籽粒果皮的最大光合能力在灌浆初期受到一定抑制，在灌浆中期表现出较好的适应性，在中后期由于籽粒衰老而迅速下降。

(4) 高浓度O₃条件下，果皮绿色层在籽粒干物质累积和营养物合成过程中发挥着更加重要的作用。