生物固氮是森林生态系统重要的氮素来源。据估计，陆地生态系统每年通过生物固定的有效氮大约为110 Tg，远远高于闪电固氮(3 Tg N/a)^[1,2]。这意味着每年有超过97%的“新”氮素是通过生物固氮进入陆地生态系统中^[3]。值得注意的是，森林是固氮微生物分布最为广泛的生态系统，如在土壤、凋落物、植物叶片、苔藓、地衣和豆科植物的根瘤等均可以发现固氮菌的存在。地球上森林的覆盖面积占整个陆地面积30%^[4]，并且固氮量达到了陆地生态系统固氮总量的近一半^[5]。通过生物固定的有效氮不仅可以提高森林的生产力，还会进一步影响生态系统的结构和功能。因此，了解森林生物固氮的影响因素将有助于我们更好地认识生物固氮对森林氮循环的影响。

一般认为环境因子(如温度、水分和光照等)的变化和矿质养分的输入均会影响生物固氮。其中矿质养分的输入，尤其是人类活动引起的氮沉降增加已成为普遍关注的焦点^[3,6]。近30年来，随着工业的发展和人口增加，化石燃料的过度使用已经悄然改变了全球氮循环的格局。据统计，目前全球多数地区的氮沉降速率已经超过10 kg N hm^-2 a^-1，远远高于生态系统的自然氮沉降(< 0.5 kg N hm^-2 a^-1)^[6]。许多研究发现，长期氮沉降可能通过增加森林土壤有效氮的含量而减弱固氮菌的竞争优势，或者通过改变固氮附生植物和结瘤植物的氮素获取方式，从而减少对固氮菌的能量分配，进一步降低森林的固氮量^[7,8]。

此外，长期氮沉降可能导致生态系统养分失衡，进而使固氮菌的生长受到其他矿质养分(如磷、钼、铁、钴等)的限制。磷元素参与微生物(包括固氮菌)细胞膜的合成、酶的活化以及信号的转导^[9]，同时也是固氮菌能源物质ATP的主要成分^[10]，因此其含量的高低直接关系到固氮菌的生长和繁殖。但土壤磷起源于岩石风化，在没有外来磷素输入的情况下，会逐渐被生物吸收消耗或形成可溶性的有机磷而流失^[11]。长期氮沉降也会通过加剧土壤磷的限制^[12]进一步抑制森林的固氮能力。另外，其他营养元素的限制，尤其是构成固氮酶蛋白的重要微量元素(如钼、铁、钴等)的缺乏，也可能会影响固氮酶蛋白的生物合成及相关功能的表达，进而制约生物固氮的过程^[13,14,15]。

我国作为全球氮沉降最严重的三大地区之一(欧洲、北美和中国)，氮沉降以每年0.41 kg/hm²的速率增加，且在2000年的记录就达到了21.1 kg N hm^-2 a^{-1[6, 16]}。大量的干、湿沉降势必会威胁到我国森林的固氮能力，并通过加剧其他矿质养分的失衡进一步干扰森林生物固氮的进行。但是，目前我国关于生物固氮的研究主要集中在农业方面，而在森林方面的报道仅有5篇，且内容主要集中在两个方面：前者只是对森林中某种结瘤植物的固氮能力进行初步报道^{[17, 18]}，缺乏对森林生物固氮的系统研究及影响因素的探索；后者主要关注环境因子(如温度、湿度等)对森林附生植物^[19]或结瘤植物^{[20, 21]}固氮的影响，却忽视了矿质养分在森林固氮中的重要性。因此，本文综述国内外关于矿质养分输入对森林生物固氮影响的研究现状，同时归纳和总结相应的机理，以期人们更好地认识森林生物固氮在全球氮循环中的重要性，进而为国内开展森林生物固氮的相关研究提供理论基础和参考。

生物固氮现象最早发现于豆科作物中，随后主要被用于提高粮食的产量。到了1894年，林业上也开始进行豆科树种和其他结瘤固氮树种的选育，并利用植物固氮的“施肥”作用来提高森林的生产力^[22]。按照目前普遍的定义，生物固氮是指固氮微生物将大气中的分子态氮固定下来，进一步转化为可以被其他生物有效利用的化合态氮的过程^[23]。在森林生态系统中，固氮微生物广泛分布于不同的组织层次，如地表层的土壤和凋落物、豆科植物的根瘤及冠层的附生植物等。根据固氮方式的差异，森林生物固氮主要为共生固氮和自由固氮两种形式。由于固氮微生物与植物之间存在复杂的关系，所以关于生物固氮的分类并没有很明确的标准^[24]。目前普遍把具有根瘤结构的固氮植物归入共生固氮的范畴，除此之外的其他固氮形式，如土壤、凋落物、植物叶片以及附生植物(苔藓和地衣)等固氮菌进行的固氮统称为自由固氮^{[5, 24]}。

衡量森林生物固氮的主要指标为固氮酶活性，通过固氮酶活性可以进一步计算森林的固氮量。随着对生物固氮的深入研究，目前已有多种方法可以有效测定固氮酶活性。如，乙炔还原法、¹⁵N同位素稀释法、¹⁵N自然丰度法、总氮差值法、酰脲估算法等^[25,26]。在森林固氮的研究中，以采用¹⁵N同位素稀释法和乙炔还原法较多，因此以下主要对这两种方法进行介绍。

¹⁵N同位素稀释法主要用于固氮植物的研究。使用该方法首先需要选取生长条件相近的非固氮植物作为参照植物。在相同条件下施加含有¹⁵N同位素的氮肥，同时保证没有其他外源氮素的干扰。随着实验的进行，参照植物从土壤中吸收含¹⁵N的氮素，而固氮植物不仅吸收土壤中的¹⁵N，还通过固氮作用吸收来自大气的¹⁴N。因为¹⁴N的“稀释”作用，经过一段时间后固氮植物体内¹⁵N /¹⁴N比例低于参照植物。通过两种植物的¹⁵N原子百分比差值以及参照植物体内的总N含量，即可计算出固氮植物的固氮量。但因为该方法需要选取参照植物，而参照植物选取的适当与否直接关系到结果的精确性，再加上¹⁵N同位素价格昂贵，所以该方法使用并不多。相比之下，乙炔还原法具有操作简单，价格便宜等优点^[27]。

早在20世纪60年代，Hardy等^[27]通过室内和野外实验发现固氮酶不仅可以固定空气中的氮气，还具有将乙炔(C₂H₂)还原为乙烯(C₂H₄)的能力。因此，利用固氮酶还原乙炔的能力，测定单位时间内乙炔减少量或者乙烯生成量即可得知固氮酶的活性。目前，在森林生物固氮的研究中普遍采用该方法，具体操作如下：将待测样品置于密闭性良好的培养瓶中，用气密注射器抽出10%的空气，同时注入相应体积的高纯度乙炔。在室内恒温条件或者野外环境下培养数小时后，用注射器抽出部分气体并收集于真空采气管中。48h内用气相色谱仪测定待测气体中C₂H₄生成量，然后计算得到固氮酶活性(nmol C₂H₄g^-1 h^-1)。理想条件下，固氮酶每还原3 mol C₂H₂与固定1 mol N₂等价，所以部分研究直接采用理想比例3 ∶ 1(C₂H₂ ∶ N₂)换算成生物固氮量(kg N hm^-2 a^-1)^{[28, 29]}。但由于不同森林的环境条件及固氮菌种类存在差异，导致转换比例也有所不同。因此，目前多数研究结合¹⁵N同位素方法对转换值进行校准，从而得到实际的固氮量^{[30, 31]}。Anderson等^[32]对乙炔还原法和¹⁵N同位素吸收法进行比较，认为只有通过¹⁵N同位素技术进行校准才能精确地估算森林的固氮量。

目前，关于氮素输入影响森林固氮的研究主要集中在“富”氮的热带森林(表1)。多数施肥试验表明，长期或短期施加氮肥均会降低固氮菌的竞争优势(如降低固氮酶的活性)，从而减少森林的固氮量。例如，Barron等^[15]在巴拿马热带成熟林的研究发现，长达7a的氮肥添加(125 kg N hm^-2 a^-1)使土壤固氮酶活性降低了75%。Crews等^[33]在热带3个铁心木成熟林中的研究也发现，施加氮肥(100 kg N hm^-2 a^-1)降低了凋落物固氮酶活性，并且在年龄最老的成熟林中的抑制作用达到极显著水平。在波多黎各热带森林中，Cusack等^[34]对森林不同组织层次的生物固氮进行研究，发现短期施加氮肥(50 kg N hm^-2 a^-1)同时降低了土壤、凋落物、附生植物叶片和苔藓的固氮酶活性。在温带森林的研究也有类似的结论，如在瑞典一个火烧后355a的温带成熟林中，短期内施加不同水平的氮肥(0.56 kg N hm^-2 周^-1或 3.18 kg N hm^-2 周^-1)分别使苔藓(Pleurozium schreberi)固氮量降低为2.8 μmol m^-2 d^-1和3.0 μmol m^-2 d^-1，且作用均达到极显著水平(P < 0.001)^[30]。但也有少数研究结果表示施加氮肥对生物固氮的影响不大^[13,35]。

除了采用施肥试验研究森林生物固氮，更多的试验是利用时间序列(如森林的不同演替阶段)代替施肥的方法实现大时间尺度的研究。目前多数研究认为，不管是在热带地区还是温带地区，处于演替初期的森林固氮速率(即固氮酶活性或固氮量)最高，随着演替的进行固氮速率开始下降。如在热带地区，Crews等^[33]对夏威夷群岛6个不同演替史的森林进行研究，发现处于演替初期的森林凋落物具有最高的固氮酶活性(4.6—9.4 nmol g^-1 h^-1)。Skujiņš，等^[36]对不同演替阶段的森林土壤和植物固氮进行综合分析，结果表明演替末期的云杉林固氮量最低(0.32 kg N hm^-2 a^-1)。在巴拿马热带森林，4种不同类型森林(自然成熟林、受干扰的成熟林、45年生次生林和季节性海岸森林)的印加树(Inga sp.)根瘤固氮存在差异，即两个成熟林的印加根瘤生物量显著低于次生林和季节性海岸森林，其中自然成熟林的根瘤固氮酶活性基本为零^[37]。除了热带森林，在温带森林也有见到类似的报道。如在瑞典北部两个温带森林中，DeLuca等^[38]使用“交互移植试验”研究依附于苔藓(Pleurozium schreberi)的蓝藻固氮情况，结果表明处于演替初期(土壤有效N含量低)的森林其蓝藻固氮酶活性高于演替末期。Hope和Li^[39]的研究也得出类似结论，即70年生—80年生的黄杉树林其凋落物和树枝固氮速率均高于450年生的黄杉林。因此，多数研究认为生物固氮主要在森林演替初期发挥作用^[39,40]，但也有少部分研究否定了该结论。例如，在夏威夷山地雨林，Matzek和Vitousek^[41]发现沿着不同土壤年龄梯度(300—4100000年)，苔藓(Bazzania)、地衣(Pseudocyphellaria crocata)和腐木的固氮量均没有发生显著变化。Vitousek^[42]甚至发现凋落物固氮酶活性随着土壤年龄梯度的增加而增加。Lagerstrm等^[43]研究也认为，苔藓(Pleurozium schreberi和Hylocomium splendens)固氮在森林演替末期发挥重要作用。这些研究说明土壤氮素含量可能不是影响森林固氮的唯一因素。

关于磷素对生物固氮起重要作用的认识主要来源于热带森林的研究。因为热带森林多数表现为磷素限制^[44]，因此研究磷素输入对热带森林生物固氮的影响具有重要的意义。目前，许多研究认为磷素输入促进了固氮细菌的生长，进而提高热带森林的固氮酶活性或固氮量(表1)。例如，Barron等^[15]在巴拿马热带成熟林的研究发现，7a的磷肥添加(50 kg P hm^-2 a^-1)使土壤固氮酶活性增加了约2倍(P < 0.007)。在热带合欢成熟林中，Binkley等^[45]利用乙炔还原法和¹⁵N同位素稀释法均证实了施加磷肥(5 g/盆 CaHPO₄)显著增加结瘤植物(Facaltaria moluccana)的固氮量。在哥斯达黎加热带成熟林，Reed等在2010年^[46]和2013年^[23]先后报道了不同磷肥试验(长期施肥150 kg P hm^-2 a^-1和单次施肥844 μg P g^-1)的结果：施加磷肥的凋落物固氮酶活性分别是对照的3倍和2倍。Grove和Malajczuk^[28]在澳大利亚一个红桉树林进行3年的磷肥试验也发现，施加低浓度(30 kg P hm^-2 a^-1)和高浓度(200 kg P hm^-2 a^-1)磷肥使林下层豆科植物的根瘤固氮量分别增加了59%和99%。此外，在热带其他成熟林^[33,35,47]和次生林^[48]的研究中也都得出了类似的结论。除了热带地区，少数温带地区的研究同样发现磷素输入可以提高森林的固氮量。如在克拉马斯温带森林，Yelenik等^[31]发现2a施加磷肥(150 kg P hm^-2 a^-1)不同程度地提高了土壤和凋落物层的固氮量。在瑞典一个赤松和云杉混合成熟林(355a)中，短期施加磷肥(0.42 kg P hm^-2 周^-1)也会轻微提高苔藓(Pleurozium schreberi)的固氮量^[30]。

尽管大多数研究结果均表明施加磷肥可以提高森林的生物固氮，但仍有少部分研究认为添加磷肥对生物固氮的影响不大。如在热带地区，Vitousek和Hobbie^[13]通过对铁心木成熟林进行长期(>10a)的磷肥添加试验，发现来自对照样方的凋落物置于施加磷肥的样方中其固氮酶活性并没有增加，这与Silvester^[49]研究结论一致。在温带地区，也有相关报道认为施加磷肥不一定会提高结瘤植物^[31]或者苔藓^[50]的固氮量。

除氮素和磷素以外，有研究表明其他矿质养分(尤其是微量营养元素)的输入也会影响森林的生物固氮，并且多数表现为促进作用(表1)。矿质养分(除N和P外)输入促进森林固氮的现象在热带地区和温带地区均可以发现。在热带地区，如Barron等^[15]对巴拿马一个成熟林进行营养元素(包括Mo,S,Cu,B,Fe,Mn,Zn,Ca,Mg等)添加处理，发现长期施肥(25 kg hm^-2 a^-1)的土壤固氮酶活性大约是对照的2倍(P<0.013)。Vitousek^[47]在美国一个铁心木(Metrosideros polymorpha)成熟林的研究证明，施加混合营养元素(除N、P外的所有营养元素)同时提高了根瘤和凋落物的固氮酶活性。通过对3个不同土壤年龄的热带森林进行研究，Crews等^[33]也发现施加营养元素均增加了3个森林的凋落物固氮酶活性，其中在土壤年龄最小(300a)和年龄最大(4100000a)的森林中促进作用均达到极显著水平(P<0.001)。在温带森林的研究也有类似的结论，如Silvester^[49]也发现添加微量营养元素可以促进凋落物固氮，其中施肥处理的固氮酶活性(15.2 nmol C₂H₄ g^-1 h^-1)显著高于对照(4.1 nmol C₂H₄ g^-1 h^-1)。此外，也有少数研究得出添加微量营养元素对森林固氮影响不显著的结论^{[13, 23, 50]}。

在影响生物固氮的众多微量营养元素中，钼(Mo)成为关注的焦点。微量元素钼和铁共同参与合成固氮酶蛋白中的钼固氮酶(也称钼铁蛋白)^{[10, 14]}。而钼固氮酶几乎存在于所有的固氮细菌中，且参与生物固氮的过程^[51]。在热带和温带森林的研究均表明，添加钼元素促进了土壤或凋落物的固氮酶活性。在热带森林，如Barron等^[15]发现钼肥添加提高了土壤固氮酶活性，并且高浓度(504 μg Mo/kg)比低浓度(42 μg Mo/kg)的促进作用更加明显；而长达7a的钼添加试验进一步证明，施加钼肥(0.01 kg hm^-2 a^-1)的土壤固氮酶活性比对照增加了4倍。同样在巴拿马热带森林，Wurzburger等^[14]对6个具有不同磷含量的森林进行研究，发现在磷饱和的森林中施加钼肥(667mg Mo/kg)可以使土壤的固氮酶活性增加3倍。Vitousek^[47]也认为，添加营养元素引起凋落物固氮酶活性的增加很可能与钼元素有关。钼元素输入对温带森林固氮的影响研究甚少，目前仅有Silvester^[49]进行过相关的报道，即钼添加处理使黄杉成熟林的凋落物固氮酶活性增加2—3倍。

总体上讲，单独施加氮肥会抑制森林生物固氮，施加磷肥则起到促进作用。氮肥和磷肥同时施加对森林固氮的影响仅在热带地区进行过报道，且氮素和磷素之间可能不存在交互作用。例如，在巴拿马科罗拉多岛的一个露天温室中，Batterman等^[52]进行了不同梯度氮肥(0,30,60 g N m^-2 a^-1)和磷肥(0,20,40 g P m^-2 a^-1)的析因设计试验，结果发现单独施加氮肥或者磷肥对印加(Inga punctata)的根瘤固氮分别起到抑制(P<0.001)和促进作用(P<0.001)，而氮肥和磷肥同时施加虽然也促进了印加的根瘤固氮，但其交互作用并不显著。Binkley等^[45]在夏威夷热带森林中的研究也发现，同时施加氮肥和磷肥(5 g/盆 NH₄NO₃ + 5 g/盆 CaHPO₄)对豆科树种(Facaltaria moluccana)的根瘤固氮没有交互作用，但却提高了根瘤固氮酶活性和单位植株的根瘤固氮量。此外，Reed等^[35]在哥斯达黎加热带森林中的研究也得到类似的结论，即同时施加氮肥和磷肥(150 kg N hm^-2 a^-1 + 150 kg P hm^-2 a^-1)也会提高凋落物和土壤的固氮酶活性。这表明磷素对生物固氮的促进作用可能比氮素的抑制作用更加强烈。

相比之下，磷和其他矿质养分同时添加对热带森林固氮的影响表现出交互作用。如，在美国热带森林中，Vitousek和Hobbie^[13]通过凋落物分解试验发现，来自对照样方的凋落物置于单独施加磷肥或T肥(T肥: 除N、P外的所有营养元素)的样方中，其固氮酶活性没有发生显著变化；但置于同时施加磷肥和T肥的样方后固氮酶活性显著增加，并且磷和T的交互作用达到极显著水平(P<0.001)。Silvester^[49]通过室内实验分析也发现，相比对照(1.0—1.6 nmol C₂H₄ g^-1 h^-1)，单独施加磷肥对凋落物固氮酶活性没有影响(1.1—1.2 nmol C₂H₄ g^-1 h^-1)，施加除氮以外的所有营养元素(包括磷等)却可以显著提高固氮酶活性(4.6—5.1 nmol C₂H₄ g^-1 h^-1)。Wurzburger等^[14]在巴拿马两个磷受限的热带森林(Zetek和Rio Paja)进行了钼和磷的添加试验，结果也表明同时添加钼(667mg Mo/kg)和磷(283 mg P/kg)会使土壤固氮酶活性增加1.5—4倍，并且钼和磷的交互作用达到显著水平。此外，Vitousek^[47]和Reed等^[23]通过研究也先后得到类似的结论，这说明热带森林生物固氮可能同时受到磷素和其他矿质养分的限制。而温带森林目前仅有Markham^[50]进行过相关报道，即磷和微量营养元素同时添加对两种苔藓(Sphagnum capillifolium 和Pleurozium schreberi)固氮的影响均不存在交互作用。

综合目前国内外的研究，矿质养分(主要为氮素和磷素)输入影响森林生物固氮的机理可以分成生物作用机制和环境作用机制两个部分。

森林的不同组织层次均有固氮菌的分布，然而它们对矿质养分输入的响应机制却存在差异。因此，本文将从森林地表的土壤及凋落物层、结瘤植物和冠层附生植物3个不同层次阐述矿质养分输入对森林固氮的影响机制。

自由固氮菌主要分布于森林的土壤和凋落物层，所以其数量或群落丰度很容易受到土壤氮、磷等养分的影响。

长期的氮素输入可能通过减少固氮菌的数量或者群落丰度，进而降低森林的固氮量。目前普遍认为，固氮菌在氮素限制的森林中具备较强的竞争优势，所以固氮酶活性比较高^[33]。然而，长期的氮素输入不断提高了土壤的氮素含量和生物总量^[54]，并加剧微生物之间的竞争。此时继续通过耗能方式进行固氮将不利于固氮菌的生存^[10]，因此固氮菌的数量逐渐减少。如在Harvard森林，Compton等^[55]研究认为长期施加氮肥增加了松林土壤固氮基因(nifH)扩增的困难性。这意味着施加氮肥可能减少了土壤固氮菌的数量，进而抑制固氮基因的表达。Kolb和Martin^[56]通过研究也发现，施加氮肥降低了土壤根际固氮菌与总细菌的比例，同时也显著降低了固氮酶的活性。此外，长期的氮素输入可能不利于对高氮环境耐受性较弱的固氮菌生存，从而降低了固氮菌的群落丰度。如，Piceno和Lovell^[57]通过氮肥添加试验研究土壤固氮基因的变化，结果发现长期施加氮肥使土壤中原本具有的优势固氮基因消失，同时也降低了土壤的生物固氮量。在长期的增温和施加氮肥控制试验中，Berthrong等^[58]发现施加氮肥降低了松林土壤固氮基因的丰度和多样性。Freedman等^[59]同样发现氮沉降降低了北方阔叶林土壤固氮基因的丰度。这表明氮素的输入通过减少固氮菌的群落丰度，进而抑制森林的生物固氮。

相反，磷素的输入可能促进固氮菌的生长并增加其群落的丰度，群落丰度的增加可以提高森林的固氮总量。如在哥斯达黎加热带雨林，Reed等^[46]发现长期施加磷肥(150 kg P hm^-2 a^-1)使凋落物产生新的固氮基因。这表明磷素的输入导致新的固氮菌(如喜磷固氮菌等)出现。此外，Reed等^[46]研究还证明了磷肥添加可以显著地提高凋落物固氮基因的丰度和固氮量，且固氮基因的丰度与固氮量之间存在显著的正相关关系(P = 0.025，r²= 0.35)。

根瘤固氮是结瘤植物最主要的氮素来源^[8]，因此根瘤的生长很大程度上受到结瘤植物的调控。矿质养分的输入可能会引起土壤养分的失衡，进而改变结瘤植物对氮素的需求，导致根瘤的生物量和固氮量发生变化。

长期的氮素输入可能会减少结瘤植物对根瘤的生物量分配，从而降低根瘤的固氮量。对于结瘤植物而言，通过根瘤固氮方式获取氮素需要消耗能量^[10]。当大量氮素进入土壤时，固氮植物会减少对根瘤的生物量分配，部分转向耗能较少的获取方式，即土壤有效氮素的吸收^[8,31]。虽然有研究表明，在土壤氮含量丰富的情况下，单位根瘤的固氮酶活性并没有发生显著变化，但是植物总的根瘤固氮量却降低了^[60]。这说明在共生固氮系统中，外来氮素的输入可能是通过减少根瘤的生物量来降低植物的固氮总量。例如，Ekblad和Huss-Danell^[61]通过温室实验分析，发现添加氮素使桤木(Alnus incana)的根瘤生物量和固氮量同时降低。Barron等^[37]采用时间序列的方法也发现类似的结论，即成熟林(有效氮含量高)的印加树根瘤生物量和固氮量均低于次生林，这表明土壤有效氮的增加会抑制根瘤的生长和固氮。

磷素的输入可能增加了结瘤植物对氮素的需求，因此结瘤植物通过增加根瘤的生物量(如根瘤的数量、干重和密度等)来提高根瘤的固氮总量。例如，Yang^[62]通过磷添加试验发现，添加磷素(0.1—1.0 μmol/L KH₂PO₄)促进了木麻黄(Casuarina cunninghamiana)及其根瘤的生长。通过温室实验的研究，Hingston等^[48]发现不同浓度的磷添加(4 mg P/kg土或10 mg P/kg土)虽然都降低了两种结瘤植物(Acacia pulchella和Kennedia prostrate)的根瘤固氮酶活性，但均提高了单位植株的根瘤数量、干重和固氮量。Grove和Malajczuk^[28]的研究也表明，不同的施肥量(30 kg P hm^-2 a^-1或200 kg P hm^-2 a^-1)分别使豆科植物(Bossiaea laidlawiana)的根瘤固氮量提高了59%和99%，并认为固氮量的增加主要是因为施加磷肥显著增加了根瘤的密度。因此，磷是限制结瘤植物生长及固氮的主要原因^[60]。

冠层附生植物(苔藓和地衣)的营养元素主要来源于大气环境^[63]，或者间接通过寄主植物叶片和树皮的淋溶析出获得^[64]。所以，短期的林下层施肥对附生植物没有直接影响，但长期的矿质养分输入可能通过改变寄主植物的营养状况，进一步影响附生植物的生长和固氮。

目前，有两种机制可以解释氮素输入对附生植物固氮的影响：(1)长期的氮素输入可能对附生植物造成毒害，进而降低其固氮能力。有研究认为，长期施加氮肥导致的过量NH⁺₄累积会对附生植物产生毒害，从而抑制附生植物的生长^[7]。其次，大量氮素的累积也会通过抑制附生植物的光合作用^[65]，进而减少光合产物并影响固氮过程对能源的需求；(2)长期的氮素输入同时也减少了附生植物的丰度。例如，在瑞典温带森林，Forsum等^[7]进行了8a的氮肥添加试验(50 kg N hm^-2 a^-1)，发现施加氮肥显著降低了苔藓(Hylocomium splendens)的丰度，这与Rnnqvist^[66]研究结论一致。Gordon等^[67]研究也发现，长期施加氮肥(50 kg N hm^-2 a^-1)使地衣的丰度减少了一半。附生植物丰度的降低在一定程度上减少了植物的固氮总量。

相比之下，长期的磷素输入反而促进了附生植物的生长并提高其丰度或者盖度，进而增加森林的固氮量。如，在夏威夷热带雨林，Benner等^[68]进行了长达14a的磷肥(100 kg P hm^-2 a^-1)添加试验，发现施加磷肥显著提高了固氮地衣(Pseudocyphellaria crocata)的丰度和固氮酶活性；通过进一步的研究发现，长期施加磷肥使地衣的固氮量增加了将近30倍，并认为这是由于地衣的丰度增加所导致的^[53]。Gordon等^[67]发现8a施加磷肥(5 kg P hm^-2 a^-1)使苔藓(Dicranum scoparium和Polytrichum juniperinum)的盖度增加13%—16%，并且在植物功能群中的比例也增加了1倍。附生植物盖度的增加很可能与寄主植物磷含量的提高有关。如，Benner^[69]在夏威夷森林的研究中发现，固氮地衣盖度较高的寄主乔木，其叶片和树皮的磷含量也相对较高(P<0.001)。这暗示了磷的输入可能通过提高寄主植物磷的含量，进而增加附生植物的盖度。附生植物盖度的增加也会提高森林的固氮总量。

固氮微生物一般倾向于生活在中性的环境中，如多数需氧型固氮菌在中性或者偏碱性的环境具有较高的固氮酶活性^[70,71,72]。外源氮素的输入可能增加了土壤NH⁺₄和NO₃^-含量并引起土壤酸化。当固氮菌处于酸性的环境时，参与固氮酶水解的发色团会发生改变，进而影响固氮反应的正常运行^[73]。因此，氮素输入引起土壤的酸化在一定程度上抑制了森林的生物固氮。Yamanaka等^[74]研究发现，日本柳杉(Cryptomeria japonica)凋落物的固氮酶活性显著高于其他两个树种(Pinus densiflora和Quercus serrata)，认为这可能与柳杉凋落物具有较高的pH有关。Zahran^[75]也认为酸性的土壤环境不利于豆科植物的生长，尤其是当pH < 5.0时，植物的结瘤效率降低，进而减少了植物的共生固氮。

长期的氮素输入除了降低土壤pH，还会导致土壤中的大量交换性阳离子(K⁺,Ca²⁺,Mg²⁺ 等)流失，同时增加了土壤可交换性Al³⁺的浓度^[76]。大量Al³⁺累积引起的铝毒效应也会进一步抑制豆科植物的生长和根瘤固氮的进行^[77]。例如，Wood等^[78]研究发现，当pH<5.0时，根瘤菌的生长和根瘤的形成都会受到抑制，而在酸性条件下同时进行添加铝处理则使两者在pH<6.0就开始受到抑制。Igual等^[79]也发现添加铝处理(>440μmol/L Al)会降低木麻黄(Casuarina cunninghamiana)的根瘤干重，并且在高铝处理下(880μmol/L Al)的固氮效率降低为原来的一半。

此外，氮素输入引起土壤酸性的增加还可能影响土壤Mo的含量。一般在酸性条件下土壤Mo含量很低^[15,49]，而微量元素Mo限制生物固氮的结论在许多研究中^[14,15,49]也已经得到证明。

多数固氮微生物在生长和固氮过程均需要从环境中获取有效的碳源，因此碳源物质的含量也是影响森林地表层(土壤和凋落物)生物固氮的重要因素。在森林生态系统中，矿质养分(如氮素)的输入主要通过影响凋落物的分解，进而改变有效碳源物质的含量^[80]。

长期的氮素输入减少了凋落物中纤维素和半纤维素的含量，同时导致木质素累积，进而减少了可被固氮微生物有效利用的碳源。目前已有多数研究证明，当外源氮素进入土壤时，微生物会提高纤维素水解酶(如β-1,4-葡萄糖苷酶和纤维素二糖水解酶等)的活性，并降低木质素氧化酶(如多酚氧化酶和过氧化物酶等)的活性，导致纤维素、半纤维素等可被利用的碳源物质越来越少^{[81, 82]}。有效碳源的减少不仅影响了固氮微生物的生理代谢，还会阻碍其生物固氮的过程。

虽然没有证据表明碳源物质的减少会直接抑制森林地表层的生物固氮，但目前已有许多研究认为土壤或凋落物的固氮酶活性与有机碳含量之间存在正相关性。例如，在哥斯达黎加热带森林中，Reed等^[35]发现土壤和凋落物固氮量在夏季最高，认为这可能是夏季湿度较高的情况下，凋落物层的可溶性有机碳增加，从而提供给固氮菌丰富的有效碳源。Wurzburger等^[14]通过研究土壤剖面不同深度的固氮酶活性，发现有机质含量丰富并且含氮量较低(也即有最高的C/N)的土壤表层固氮酶活性最高。在夏威夷热带森林，Vitousek^[42]的研究也发现凋落物的自由固氮酶活性与其获取的能量(碳源)有关。Pérez等^[83]在温带成熟林中的研究也表明，若凋落物含有较高的C/N，相应的固氮酶活性也比较高。

从现有的研究来看，多数森林固氮的研究对象只是局限于某些固氮能力较强的植物，而这种局部性的研究并不能代表整个森林或者区域的固氮情况^[3]。其次，在森林的不同组织层次均有固氮植物或者固氮微生物分布，但多数研究的对象只是局限于森林中某个类群，比如苔藓、地衣、豆科固氮植物，或者局限于某个组织层次，如土壤层、凋落物层，而缺乏对整个森林的系统估算。目前，国外如Cusack等^[34]对森林生物固氮进行过比较系统的报道，而国内还未在该领域进行系统的研究。从全球尺度上讲，目前有关陆地生态系统生物固氮的报道主要集中在欧洲和北美等少数地区，在豆科植物广泛分布的亚洲、非洲和南美洲等地区的研究却相当缺乏^[5]。中国固氮植物资源丰富，因此加强和开展国内森林共生固氮和自由固氮的研究将有助于我们认识全球变化(如氮沉降等)对我国森林氮循环的影响。

森林生物固氮会呈现一定的日变化或者季节变化，因此某个时间点的采样结果并无法代表森林的实际固氮量^[29]。其次，短时间尺度的研究也可能会误导我们对森林固氮的认识。比如短期添加营养元素对某些附生植物的影响可能不明显，但长期施肥通过间接方式改变了附生植物的固氮速率^[68,84]。所以，目前多数短期施肥的控制性试验的研究(特别是温室实验)无法完全反映森林的真实固氮。在美国、瑞典、智利等部分区域采用空间代替时间的方法研究大时间尺度下的森林固氮差异，然而这样的研究方法在其他地区(如亚洲地区)的应用却非常少。我国具备从热带至寒带不同气候条件的森林生态系统，随着中国生态系统研究网络(CERN)的建立和逐步完善，该网络体系将有助于我们实现不同区域或年龄段森林生物固氮的合作研究，更好地理解森林生物固氮的机理。

关于固氮酶活性的测定方法有很多种，但是不同的方法各有其优缺点。例如，¹⁵N同位素稀释法虽然可以比较精确地测定固氮酶活性，但该方法主要运用在固氮植物的研究，对土壤或者凋落物等自由固氮并不适用。乙炔还原法虽然操作简单，但其测定值只能反映固氮酶在理想条件下的最高活性，因此可能会高估森林实际的固氮量^[85]。其次，在森林固氮量的换算中，部分研究直接采用理想比例(3 ∶ 1)进行计算无法反映实际的固氮情况。此外，方法上的不统一，如不同的培养时间、培养条件(温室或野外)、转换比例(理想比例或实际比例)等，也会使不同森林固氮量之间缺乏可比性。因此，加强我国生物固氮相关测定方法的研究并与国际上的新方法接轨，可以更为精确地估算不同森林类型的生物固氮量。

国内外对森林固氮的研究仍然停留在固氮酶活性的分析。引起固氮酶活性变化的更深层次机理还不清楚，尤其在固氮菌群落结构和功能方面的研究甚少。目前，国际上已有部分研究利用分子生物学的方法，证明了养分添加影响森林固氮菌群落的丰度^[55,58,59]，但在国内仍未见到相关的报道。其次，养分的输入究竟是影响了森林中哪些类群的固氮菌生长，以及哪些固氮菌对森林固氮量的贡献最大等都还没有得到有效的鉴定。随着我国分子生物学的发展，基于PCR技术的RFLP、t-RFLP、DGGE和基因探针杂交等方法将有助于我们对固氮菌的群落结构进行深入分析。因此，利用分子技术研究森林生物固氮将是研究的重点。