我国传统优势栽培地区的苹果园主要是20世纪80年代和90年代初建立的，现在大部分进入衰老期，其中20—30a园龄的占20%以上，每年有2—3.13万hm²的老果园面临重建^[1]。而果园重建常常面临一个严重的问题——苹果连作障碍(再植病、忌地现象)。连作障碍使树体生长势变弱、病虫害加剧、产量降低、果实品质下降，严重制约了我国苹果产业的可持续发展。因此，深入的探讨苹果连作障碍的发生机理，研究建立有效苹果连作障碍防控技术体系，对苹果产业的可持续发展具有重要意义。

大量研究表明，根系分泌以及前茬残根腐解产生的酚酸类物质是引起连作障碍的重要原因之一^{[2, 3, 4]}。这些酚酸类物质主要包括根皮苷、苯甲酸、间苯三酚、根皮素、阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、咖啡酸等^[5]。孙海兵等^[6]研究环渤海湾地区连作苹果园土壤中酚酸类物质的含量变化时，发现根皮苷、焦性没食子酸和绿原酸可能是引起连作障碍的关键物质。覃逸明等^[7]用凤丹根分泌的阿魏酸、肉桂酸、香草醛、香豆素以及丹皮酚对丹凤幼苗的进行盆栽试验，发现酚酸类物质影响根系酶活性和叶绿素合成，进而认为凤丹连作障碍可能主要与自身分泌到土壤中的酚酸类物质的自毒作用有关。

就现有的研究成果来看，关于酚酸类物质毒害作用的研究，大多是外源施入预先设定的酚酸类物质，按照人为的浓度梯度进行试验^{[8, 9]}，或者用根际土壤浸提液、植株不同部分浸提液、根系分泌物进行综合伤害检测^{[10, 11]}。而在实际生产中，自毒物质的类型和含量在不同的土壤类型、不同植物品种或品系间存在很大的差异^{[12, 13]}，因此在研究降解酚酸类物质来缓解连作障碍时，应针对土壤中实际存在的有害物采取措施，而不能“一刀切”。至今，关于连作果园土壤中实际浓度的酚酸类物质对作物的影响鲜有报道。因此，本研究在砂培条件下，用连作土壤中有代表性的5种酚酸类物质，以其田间实测的浓度处理平邑甜茶幼苗，通过研究其对平邑甜茶幼苗根系线粒体功能以及抗氧化性酶活性、膜透性和过氧化氢、超氧阴离子自由基含量等指标的影响，探讨连作土壤中实际浓度的酚酸类物质对平邑甜茶幼苗的影响，以期为研究减轻苹果连作障碍技术提供理论依据。

试验于2013年在山东农业大学园艺科学与工程学院根系实验室进行。供试材料为苹果常用砧木-平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)。供试分析纯试剂根皮苷、间苯三酚、根皮素、对羟基苯甲酸、肉桂酸购自美国Sigma公司。培养基质为河砂，砂石用水洗涤干净，备用。

于山东省泰安市瓷窑镇大磨庄村选取1333m² 20年生红富士苹果园，砧木为八棱海棠(M. micromalus)，进行更新重建。土壤类型为褐土，土壤硝态氮含量为11.39 mg/kg，铵态氮含量为 2.32 mg/kg，速效钾含量为70.0 mg/kg，速效磷含量为25.4 mg/kg，有机质含量为5.1 g/kg。幼树为富士-平邑甜茶二年生嫁接苗，按照原树穴、原树株间、原树行间的布局进行栽植。连作第2年，在新建苹果园中，从上述3个位置，采用多点取样法，取0—30 cm土层土壤混合，室温风干，过12目筛，用加速溶剂萃取法提取土壤中酚酸，然后进高效液相色谱仪分析酚酸类物质的含量^[5]。所测5种酚酸类物质的含量如下：根皮苷，6.0 mg/kg、间苯三酚，1.3 mg/kg、根皮素，0.05 mg/kg、对羟基苯甲酸，0.3 mg/kg、肉桂酸，0.06 mg/kg。根据所测酚酸类物质含量，用小于0.2% (体积分数)乙醇溶液配制相应浓度的根皮苷、间苯三酚、根皮素、对羟基苯甲酸、肉桂酸溶液，备用。

将平邑甜茶种子层积、催芽后播种于营养钵(高10 cm、直径10 cm)中，将营养钵放在不漏水的托盘内，每钵6粒，用50 mL Hoagland营养液每3 d浇灌1次，待幼苗长至3片真叶，选长势基本一致保留3株，保证各处理条件一致。待幼苗长至10—11片功能叶后，对其进行处理，试验处理见表1，每处理12钵。将5种酚酸按所测的土壤中的含量分别施入营养钵中，5 d处理1次，每次20 mL，若有流出则将托盘中的流出液倒回营养钵，如此反复操作，使处理营养钵中的酚酸浓度与连作果园土壤中的浓度相一致，共处理3次。第1次处理15 d后，取样进行各项生理指标的检测。

(1)根系指标的测定

将处理后幼苗取出，用水小心洗净根系，将根系平铺于透明硬塑料板上，在水中将根系展开，用专业版WinRHIZO(2007年版)根系分析系统获取根系扫描图形，记录总根长、平均根直径^[14]。

根冠比=地下干物质量/地上干物质量

(2)线粒体的提取及指标测定

线粒体用差速离心法^[15]提取，放在冰上保存备用。

将线粒体提取液充分摇匀，参照Marchi等的方法^[16]，于540 nm处测定吸光度变化，检测线粒体膜通透性转换孔(MPTP)。以单位质量根系线粒体引起的每分钟吸光度变化表示MPTP开放程度。

将线粒体提取液颠倒摇匀后，按照Braidot等的方法^[17]用RF-5301PC荧光分光光度计测定线粒体膜电位，激发波长505 nm，发射波长573 nm，狭缝宽度5 nm。以单位质量根系线粒体引起的荧光强度表示线粒体膜电位的大小。

将线粒体提取液轻轻颠倒摇匀后，用UV-2600紫外可见扫描分光光度计(岛津，日本)测定550 nm和630 nm处的吸收值。以单位质量根系线粒体的2种波长的吸收值之比来计算细胞色素Cyt c/a^[18]。

(3)抗氧化酶活性测定测定

氮蓝四唑(NBT)光还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性^[19]；按Omran^[20]的方法测定过氧化物酶(POD)的活性；用Kar等^[21]的方法测定过氧化氢酶(CAT)的活性。

(4)超氧阴离子自由基(O₂^·-)产生速率、H₂O₂含量和膜脂过氧化的测定

采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量^[22]，采用赵世杰等的方法，利用紫外分光光度计检测415 nm处的吸收值测定H₂O₂的含量^[22]。羟胺反应法测定O₂^·-的产生速率^[23]。

采用Excel 2003完成对试验数据的计算和制图，通过SPSS 19.0中ANONA进行方差分析，Duncan′s 新复极差法进行差异显著性检测。

由表2可知，土壤实测浓度的酚酸类物质均降低了平邑甜茶幼苗地上部干重，除间苯三酚外，其余酚酸类物质使地下部干重显著降低，其中以6 mg/kg根皮苷处理对植株重量影响最大，地上、地下部降低幅度分别达32.9%和56.5%。根冠比的降低说明，酚酸类物质对根系的影响程度大于地上部，其中根皮苷处理根冠比下降幅度最大，降幅为34.4%。

5种酚酸类物质均使得总根长以及平均根直径呈明显的下降趋势(表2)，以根皮苷处理抑制力最强。总根长数值大小依次是根皮苷＜根皮素＜肉桂酸＜对羟基苯甲酸＜间苯三酚＜CK，平均根直径以根皮苷处理降幅最大，降幅为27.9%，其余酚酸类物质处理比对照降低9.6%—23.1%。可见，酚酸类自毒物质对平邑甜茶幼苗根系有较强的抑制作用，是造成连作障碍的因素。

线粒体通透性转化孔(MPTP)开放，引起线粒体内膜对甘露醇和蔗糖高通透性，因此造成线粒体肿胀，即表现为线粒体悬浮液吸光度值降低，因而可通过测定吸光度值得变化间接反映MPTP的开放程度。不同酚酸类物质处理均使得线粒体吸光度值降低(图1)，这表明酚酸类物质会诱导MPTP开放程度增加，以根皮苷处理使得MPTP开放程度最大，间苯三酚处理开放程度最小。

图 1 不同酚酸类物质处理对平邑甜茶幼苗根系线粒体MPTP、膜电位和cyt c/a的影响 Fig.1 Effects of phenolic acids on mitochondrial MPTP, membrane potential, and cyt c/a in root of Malus hupehensis Rehd 根皮苷 phloridzin; 间苯三酚 phloroglucinol；根皮素 phloretin; 对羟基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid；肉桂酸 cinnamic acid；图中不同小写字母表示不同处理间的差异(P＜0.05)

图选项

线粒体膜电位是指生物膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，反映了线粒体功能的完整性，是评价线粒体功能的敏感指标。线粒体的膜电位与MPTP开放程度有关，MPTP高通透性开放，则引起膜电位的降低^[24]。根皮苷、间苯三酚、根皮素、对羟基苯甲酸和肉桂酸处理后，幼苗根系线粒体膜电位分别为对照的54.2%、78.7%、65.1%、70.8%和77.6%，显著低于对照(图1)。

与对照相比，酚酸处理平邑甜茶幼苗，使得根系线粒体细胞色素Cyt c/a显著降低(图1)，以根皮苷处理降低程度最大，为对照的74.3%，间苯三酚处理影响最小。这说明酚酸类物质破坏了线粒体膜的完整性，在线粒体不断肿胀的过程中，膜电位降低，细胞色素c不断流失。

由图2可以看出，5种酚酸类物质处理平邑甜茶幼苗后，均显著降低了根系抗氧化酶活性。各种酚酸处理后，根系SOD活性由小到大的顺序依次是：根皮苷＜根皮素＜肉桂酸、对羟基苯甲酸＜间苯三酚＜对照，POD、CAT活性变化与SOD变化趋势一致。根皮苷处理后，根系SOD、POD和CAT活性分别为对照的16.4%、29.6%和27.5%。

图 2 不同酚酸类物质处理对平邑甜茶幼苗根系SOD、POD和CAT的影响 Fig.2 Effects of phenolic acids on SOD, POD, and CAT activities in root of Malus hupehensis Rehd. seedling

图选项

由图3可以看出，5种酚酸类物质均可导致平邑甜茶幼苗根系膜透性增大，具体表现为MDA的含量显著升高，根皮苷、间苯三酚、根皮素、对羟基苯甲酸和肉桂酸处理幼苗根系MDA含量分别是对照的6.3、1.3、5.5、1.7和3.3倍。

图 3 不同酚酸类物质处理对平邑甜茶幼苗根系MDA、H2O2和O2·-的影响 Fig.3 Effects of phenolic acids on the concentration of MDA、H2O2 and O2·- in root of Malus hupehensis Rehd. seedling

图选项

酚酸类物质处理后，根系H₂O₂含量均显著升高，根系H₂O₂含量由大到小的顺序依次是：根皮苷＞根皮素＞对羟基苯甲酸＞肉桂酸＞间苯三酚＞对照。O₂^·-含量的变化趋势与H₂O₂含量变化基本一致。

苹果连作障碍是在全世界主要苹果产区普遍存在的问题。早期对苹果连作问题进行了大量的研究，发现苹果连作障碍的重要原因之一是土壤中存在有害酚酸类物质^[25]。本实验室经过大量试验摸索，发现一种简便、快速和高效提取、测定连作苹果园土壤中酚酸含量的新方法^[5]，这为后续试验奠定了基础。

土壤中酚酸类物质的积累是作物根系受到的一种逆境胁迫^{[10, 26]}，酚酸类自毒物质不仅抑制作物地下部的生长，而且阻碍地上部的发育^{[11, 26, 27]}。张江红等^[27]用浓度为1 mmol/L的根皮苷处理平邑甜茶幼苗，发现幼苗的根系长度和表面积大幅下降，根尖的超微结构受到破坏，根系的吸收能力严重受到影响。本试验结果也发现，连作果园中实测浓度的5种酚酸类均抑制了平邑甜茶幼苗植株的生长，使幼苗根系干物质量明显降低，降低幅度在23.9%—56.5%，而地上部干物质的量减小幅度在6.3%—34.4%。其中根皮苷、根皮素、对羟基苯甲酸以及肉桂酸处理根冠比下降幅度明显，证明这些酚酸类化合物对根系的影响程度大于地上部分。在酚酸类物质胁迫下，幼苗总根长和平均根直径均有所下降，这些指标的下降导致根系对养分吸收能力的降低，最终使得地下部干物质积累量的减少。

在正常的生理状态下，植物组织中的活性氧产生与清除处于平衡状态，一旦植物受到逆境胁迫，这种平衡体系就会遭到破坏，致使自由基过量积累，细胞膜通透性增加，代谢紊乱，最终使植物受到伤害^[28]。有研究表明，一定浓度的酚酸处理可使黄瓜幼苗细胞内线粒体、质体、核膜、内质网膜受到不同程度的损伤，膜结构和功能发生改变^{[29, 30]}。SOD、POD和CAT等是清除植物体内活性氧(ROS)过程中重要的抗氧化酶，能有效抑制自由基的过量累积。在本试验中，连作土壤实测浓度的酚酸类物质，使平邑甜茶幼苗根系内的抗氧化酶POD、SOD和CAT活性显著降低(图2)，同时O₂^·-产生速率、H₂O₂含量大幅度增加，这与前人研究结果一致，即在连作条件下，土壤中酚酸类物质大量积累，使得植物抗氧化系统受到破坏^[31]，不能有效清除自由基，造成自由基过量积累。过了的ROS引起的氧化损伤使得系线粒体的电子传递受阻，线粒体内膜的完整性和呼吸电子传递链受到破坏，反过来进一步破坏线粒体的抗氧化防御体系，使线粒体O₂^·-产生速率加快、H₂O₂和MDA含量增高、膜脂过氧化加剧，最终破坏线粒体的结构和功能，植物生长受到抑制乃至死亡^[24]。土壤浓度的5种酚酸使幼苗根系线粒体发生了不同程度损伤，具体表现为线粒体悬浮液的光密度显著降低，表明线粒体肿胀，线粒体通透性转换孔(MPTP)过度开放。MPTP的过度开放会导致MPT增大，呼吸链解耦联，线粒体电位下降甚至消失，而MPTP和膜电位不断下降的过程中，Cyt c/a同样逐渐降低(图1)。由于线粒体内膜的高选择透性，线粒体较少受到外界环境的影响，MPTP周期性开放，进而维持线粒体内电化学平衡态，保持氧化还原管路的畅通，作为电子传递链组成成分的Cyt c松散地结合在线粒体内膜上，而Cyt a则紧密结合在线粒体内膜上^[15]。但在逆境胁迫条件下，线粒体在能量合成和转换过程中也会受到影响，产生氧应激^[24]。从图1、图2、图3中可以看出，抗氧化酶系统清除活性氧能力降低的同时，ROS的含量显著增加，线粒体功能遭到严重破坏。这可能是因为过量的ROS与线粒体膜电位降低间存在着相互促进的现象^[32]。抗氧化酶活性降低后，不能及时清除过多的ROS，因而，这些活性氧就会攻击膜系统，使膜脂质过氧化，导致一系列膜功能障碍，进一步会提高线粒体膜通透性，膜电位的持续下降，Cyt c从内膜上脱落并可能进入细胞质，呼吸链解偶联，能量产生中断，致线粒体水肿程度更大并导致线粒体膜破裂，最终导致细胞的死亡^{[15, 33]}。

不论是由线粒体数据，还是植株的生物量数据，都可以看出，5种连作土壤实测浓度的酚酸类物质对平邑甜茶幼苗的伤害程度不同，其中以根皮苷毒害作用最大。但关于酚酸类物质在连作园起毒害作用的临界值，以及各种主要酚酸类物质的复合效应有待深入研究。