近年来，由于全球气候变化和人为活动的影响，以及大气氮沉降的加剧，世界范围内水体氮污染普遍存在^[1]。大气氮沉降以及硝酸盐的过量导致水体可溶性氮大幅度增加，我国水体氮污染状况不容乐观^{[2, 3]}。植物修复是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物，达到降低或清除污染物的一种环境修复技术^[4]。植物修复因其具有高效、经济和景观效果好等特点，普遍被应用于土壤、水体污染的修复研究^{[5, 6]}。目前，对水体富营养化的修复研究大多集中于水生和草本植物等，对木本植物的相关研究则较少^{[5, 7]}。柳树性喜湿，根系发达，适应性强，生长速度快，耐水性好，常于水旁栽植，对水体氮、磷污染有很好的修复作用，是应用于富营养化水体植物修复的重要树种^{[8, 9]}。

氮是核酸、蛋白质和其他有机分子以及他们的分解代谢产物不可或缺的组成元素^［10]。但环境中过量氮的存在，会引起植物生理特征变化。例如，NH₄⁺过量会使得大部分植物生长、生理特征的改变，甚至引起植物体内矿质元素、有机离子和氨基酸等含量的变化^{[11, 12]}。在植物根系环境中，过多的NH₄⁺或者NO₃^-存在时，不但对大多数植物具有毒害作用，而且会进一步影响其不同部位对氮的吸收、积累和分配^[13]。同位素示踪技术是指外源添加与生物体内的元素或者物质完全共同运行的示踪物，用来指示其内部某元素或物质变化过程的一种方法^[14]。利用氮稳定同位素示踪技术，能从本质上揭示相关生态学过程发生的机理，从而成为生态学科研工作十分重要的工具之一^[15]。有研究表明，基于¹⁵N的标记特性、可测定性及与普通氮易于区别的特点，研究中运用¹⁵N示踪技术，可以让我们更好地理解植物对不同氮素吸收和分配机理^{[16, 17, 18]}。

本文选用常见速生柳——旱柳(Salix matsudana)作为试验材料，采用溶液培养法，通过外源添加NH₄⁺-N和NO₃^--N，考察速生旱柳苗在不同浓度的2种单一氮源处理下对氮的吸收、分配情况，以及生长和生理响应特征，预期为柳树用于氮污染水体的修复提供理论基础和科学依据。

实验选用的柳树无性系于2013年3月份引种于山东滨州一逸林业有限公司，为旱柳无性系27号。将柳树枝条剪成10cm长插条，均匀扦插于40cm×20cm的有孔泡沫板中，每个泡沫板上扦插12棵插条，置于19L的方形塑料箱中培养。自然光照强度下，温度为20—30℃，每天光照约10h。用改进的Hoagland营养液配方培养^[19](营养液成分为：0.51 g/L KNO₃，0.82 g/L Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.136 g/L KH₂PO₄，0.49 g/L MgSO₄·7H₂O，2.86 mg/L H₃BO₃，1.81 mg/L MnCl₂·4H₂O，0.22 mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.45 mg/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄，0.6 mg/L FeSO₄，0.744 mg/L EDTA)。保持24 h通气，每7 d更换1次营养液，营养液pH控制在6.5左右。待柳树幼苗生长3个月后，选取长势良好且生长基本一致的幼苗，通过测定株高和整株生物量，选取长势一定(株高±<5 cm、株生物量±<10 g)的柳树苗用于试验。柳树苗先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗后晾干10 min左右，放入无离子水中培养，1周后达到氮饥饿状态，进行氮吸收试验。

将处理好的柳树苗置于19 L的方形塑料箱中，每箱8棵，用海绵和泡沫板固定，共48箱，用不含KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O，含有CaSO₄的上述Hoagland配方1/4倍的营养液，以保证柳树能正常生长，同时设置不同氮处理进行培养。氮分别以(¹⁵NH₄)₂ SO₄(NH₄⁺-N)和K¹⁵NO₃(NO₃^--N)(购自上海化工研究院，丰度为99.99%)形式添加，根据水体富营养化分级标准^[20]，将氮浓度设置为1.4、2.8、7.0和28.0 mg/L 4个浓度水平(以N计)，分别代表贫氮(N1)、中氮(N2)、富氮(N3)和过氮(N4)水平，共8个处理，每个处理2箱，共16棵柳树苗，并设置3次重复。每7 d换1次营养，其中NH₄⁺-N处理组加入0.588 mg/L硝化抑制剂(C₂H₄N₄)(每箱2 mL)，以防止¹⁵NH₄⁺向¹⁵NO₃^-的转化。整个试验于2013年3—8月份在中国林科院亚热带林业研究所温室大棚和实验室中进行，研究所位于浙江省富阳市，海拔90 m，亚热带季风气候，年平均气温16.2 ℃，年平均降水量1452 mm。

第28天收获植株时，每个处理取出6棵叶片和根系完整的柳树苗，测定其鲜重和干重，在实验室用去离子水洗净，分根、茎、叶，在实验室晾干测定鲜重；测定干重样品在105 ℃下杀青0.5 h后，在75 ℃下烘干72 h，用感量为0.01 g的电子天平称量，统计单株根系和地上部(茎和叶)的生物量。

用于测定各部分δ¹⁵N含量的柳树苗，分别第7、14、21天和第28天在每个处理取出6棵柳树苗，测定鲜重和干重，方法同上。烘干后粉碎过100目筛，用于测定δ¹⁵N含量。用DELTA V Advantage同位素比率质谱仪和Flash EA1112 HT元素分析仪(Thermo Fisher Scientific，美国)测定样品中的δ¹⁵N值(误差值控制在±<0.2‰)。参考林光辉^[21]和赵登超^[22]等，计算得到柳树各器官的氮原子百分含量Atom%¹⁵N(AT%)、¹⁵N吸收量、来自氮源的N%(Ndff%)和¹⁵N分配率。

所有氮处理在培养的第28天上午，在剩余完整柳树中取其第3—5叶位成熟叶片和长势良好的根系若干，立即于4 ℃左右低温冷藏带回实验室进行生理指标的测定，试验均重复3—6次。根据课题组前期的研究和预实验，测定柳树苗叶片和根系相关生理指标：过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚氧化法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法测定，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；根系活力采用α-萘氧化法测定^{[23, 24]}，CAT测定在24 h内完成，其它指标均在48 h内完成测定；根系形态采用全自动双光源根系扫描分析仪测定，分析软件为Regent Instruments公司提供的WinRHIZO Pro 2005b，由此得出试验柳树苗的根系长度、根面积、根体积、根平均直径和根尖数。

数据采用Excel 2007进行初步分析整理，用SPSS 18.0进行方差齐性检验，对柳树苗生物量、¹⁵N含量、叶和根各生理指标以及根系形态指标作单因素(NH₄⁺-N或NO₃^--N)ANOVA分析，并用LSD作多重比较分析(P＜0.05)，采用Origin 7.5制图。

不同氮处理下，旱柳苗单株地下部和地上部的生物量(以干重计)差异显著(P＜0.05)，且2种氮对根系和地上部的影响不同(表 1)。结果表明，一定范围氮浓度的增加能够促进旱柳的生长，但过量氮会抑制其生长，且NH₄⁺-N的抑制作用大于NO₃^--N；旱柳表现出对NH₄⁺-N的吸收偏好，在同一氮水平时，旱柳各部位的AT%、¹⁵N吸收量和Ndff%均为NH₄⁺-N处理大于NO₃^--N处理，且随着处理浓度的增加，差异增大，其在旱柳各部位的分布为根﹥茎﹥叶；而最终能够被旱柳同化利用的氮表明，除茎中N%含量在NO₃^--N中氮水平最高外，其它均在富氮时达到N%的峰值，过量氮并不能够完全被旱柳同化、利用。表明2种氮素对旱柳的生长及氮吸收的影响不一，尤其在高浓度氮(富氮和过氮)时呈显著性差异(P＜0.05)，这可能与旱柳对2种氮素的选择性吸收不同，且可能存在不同的运输途径，从而导致结果不一。

4个氮浓度中，在4个取样阶段均为NH₄⁺-N处理高于NO₃^--N处理，表明旱柳对2种无机氮的吸收更偏向于NH₄⁺-N；其中，仅有在中氮水平时，旱柳根和叶的AT%含量呈显著性增加，且呈现出持续增加的趋势；而在贫氮、富氮和过氮水平下，根或叶在2种氮的吸收过程中，AT%含量在其不同时期出现了一定程度的下降，即发生不同程度的吸收停止现象(图 1)。这可能是由于旱柳根系对2种氮素的亲和性不同以及不同氮素对旱柳苗的生理变化特征的影响不同引起的。植物中的¹⁵N随时间而富集，但NO₃^--N处理中，在开始的14 d变化不大，表明在开始吸收了¹⁵N后就基本停止了吸收；而NH₄⁺-N处理中，柳树对培养液中¹⁵N的吸收则一直持续^{[12, 25]}，叶片吸收氮在14 d后反而下降，可能由于部分¹⁵N发生硝化作用或者其它迁移转化等^[26]。

图 1 不同氮处理对旱柳吸收、分配水体氮素的影响 Fig.1 Effects of different nitrogen treatments on the absorption and distribution of nitrogen in Salix matsudana 不同大写字母表示NH4+-N处理间柳树指标差异显著(P＜0.05)，不同小写字母表示NO3--N处理间柳树指标差异显著(P＜0.05)，*表示NH4+-N和NO3--N之间差异显著(P＜0.05)

图选项

随着氮浓度的增加，两种氮素对旱柳各器官¹⁵N分配率的影响差异显著(P＜0.05)(表 2)。NH₄⁺-N处理中，随着氮浓度的增加，根中¹⁵N分配率呈先增加后减少的趋势，在中氮水平达到最大值，叶中¹⁵N分配率呈逐渐减少的趋势，其最大值出现在贫氮水平；NO₃^--N处理中，随着氮浓度的增加，根中¹⁵N分配率呈先增加后减少的趋势，在富氮水平达到最大值，叶中¹⁵N分配率呈逐渐增加的趋势，其最大值出现在过氮水平。

旱柳叶CAT活性随着营养液中氮浓度的升高，NH₄⁺-N处理呈先减少后增加的趋势，NO₃^--N处理呈现S形变化，NH₄⁺-N处理最大值出现在过氮水平，为比对照增加了252.02%，NO₃^--N处理最大值出现在富氮水平，比对照增加了122.07%；而在根中，其CAT活性值变化规律表现为：随着营养液中氮浓度的升高，NH₄⁺-N处理和NO₃^--N处理均呈现先减少后增加的趋势，NH₄⁺-N和NO₃^--N处理最大值均出现在过氮水平，比对照增加了155.75%和638.87%(图 2)。

图 2 不同氮处理对旱柳叶和根CAT活性的影响 Fig.2 Effects of different nitrogen treatments on the activity of CAT in leaf and root of Salix matsudana 不同大写字母表示NH4+-N处理间柳树指标差异显著(P＜0.05)，不同小写字母表示NO3--N处理间柳树指标差异显著(P＜0.05)

图选项

旱柳叶POD活性值，随着营养液中氮浓度的升高，NH₄⁺-N处理呈先减少后增加的趋势，NO₃^--N处理则相反，呈现先增加后减少的趋势，NH₄⁺-N处理最大值出现在过氮水平，比对照增加了80.14%，NO₃^--N处理最小值出现在贫氮水平，比对照减少了39.52%；而在根中，其POD活性在2种氮处理中变化趋势一致，均为先增加后减少，其中NH₄⁺-N处理最大值出现在过氮水平，比对照增加了47.03%，贫氮时最小(比对照减少了47.48%)，NO₃^--N处理最大值出现在过氮水平，比对照增加了137.79%(图 3)。

图 3 不同氮处理对旱柳叶和根POD的影响 Fig.3 Effects of different nitrogen treatments on the activity of POD in leaf and root of Salix matsudana

图选项

旱柳叶SOD活性值，随着营养液中氮浓度的升高，NH₄⁺-N处理呈先减少后增加，NO₃^--N处理则表现为一直增加的趋势，其中NH₄⁺-N处理最小值出现在过氮水平，比对照减少了52.77%，NO₃^--N处理最大和最小分别出现在过氮水平和贫氮水平，分别比对照增加24.48%和减少21.78%；而在根中，其SOD活性值随着营养液中氮浓度的升高，NH₄⁺-N处理呈现出S形变化，NO₃^--N处理则表现出先减少后增加的变化过程，其中NH₄⁺-N处理最大值出现在贫氮水平，比对照增加了39.49%，NO₃^--N处理最大值出现在过氮水平，比对照增加了53.89%(图 4)。

图 4 不同氮处理对旱柳叶和根SOD的影响 Fig.4 Effects of different nitrogen treatments on the activity of SOD in leaf and root of Salix matsudana

图选项

关于不同氮处理对旱柳叶和根中MDA的含量的影响，随着营养液中氮浓度的升高，在叶中，与对照相比，NH₄⁺-N和NO₃^--N各处理间的差异较小，无显著性差异(P＜0.05)，而在根中，2种氮处理变化趋势一致，均表现为先增加后减少的变化趋势，其中NH₄⁺-N处理最小值出现在贫氮水平，比对照减少了36.16%，NO₃^--N处理最小值出现在过氮水平，比对照减少了29.85%(图 5)。

图 5 不同氮处理对旱柳叶和根MDA的影响 Fig.5 Effects of different nitrogen treatments on the contents of MDA in leaf and root of Salix matsudana

图选项

随着营养液中氮浓度的升高，旱柳根系活力差异较大。其变化规律分别为：NH₄⁺-N处理呈现出先增加后减少的变化趋势，最小值出现在富氮水平，比对照减少了50.61%，NO₃^--N处理则随着培养液中氮浓度的增加，根系活力进一步提高，根系活力最高的为过氮水平，比对照提高了19.53%(图 6)。

图 6 不同氮处理对旱柳根系活力的影响 Fig.6 Effects of different nitrogen treatments on the root activity of Salix matsudana

图选项

随着水体氮浓度的增加，旱柳苗的根系形态指标基本呈先增加后减少的趋势(表 3)。除NH₄⁺-N处理中柳树苗的根平均直径和NO₃^--N处理中柳树苗的侧根数最大值均出现在对照(中氮水平)时，表明2种氮缺乏或过量均对其有抑制作用。在贫氮水平，NH₄⁺-N处理柳树苗根总长、根表面积、根平均直径、根体积和侧根数分别对对照减少了10.38%、8.02%、12.52%、19.66%和17.73%；NO₃^--N处理柳树苗相应的根系形态指标分别对对照减少了11.88%、31.05%、0、21.04%和36.20%。在过氮水平，NH₄⁺-N处理柳树苗根总长、根表面积、根平均直径、根体积和侧根数分别对照下降了30.92%、29.48%、19.44%、27.01%和36.41%；NO₃^--N处理的柳树苗相应的根系形态指标分别对对照下降了1.66%、5.65%、1.49%、5.06%和25.72%。

关于不同形态氮引起不同结果的假设目前有：(1)离子间的拮抗与互相促进作用，以及高浓度NH₄⁺存在时通常引起植物对碳水化合物的更高需求^[11]；(2)通过改变外界环境因子(比如温度和光强等)，可以在一定程度改变植物体氮素的分布格局；(3)供应的氮素形态不同，通常对植物生长和生理特征影响不同，通常高浓度的NH₄⁺-N会对植物产生一定的毒害作用^[27]。除此之外，由于植物对不同形态氮源的敏感度不同，且水体不同pH值也会对植物吸收和分配氮素产生影响，植物吸收和分配氮素的途径也存在多样化，这些都会造成植物体内¹⁵N含量的差异^[11]。在NH₄⁺胁迫下，不同的植物或者同一植物的不同品种之间表现出实质性的变化；但目前仍无统一的结论，NH₄⁺通常会增加或减少一些复杂的生理过程；其化学机制目前仍不是很清楚，在揭示植物在NH₄⁺胁迫下的反应研究中，有研究者认为根际NH₄⁺过量造成植物碳消耗增大，故适量增加植物根际环境碳源供给可以缓解NH₄⁺的毒害作用，此外还有一方面是对渗透调节的改变，增加钾离子的供给也可以缓解NH₄⁺的毒害作用^[12]。本研究表明，2种氮素不足或过量均对旱柳根系有抑制作用，不同形态氮处理时，与对照相比，NO₃^--N处理在氮不足时对柳树苗根系形态的抑制作用大于NH₄⁺-N处理，NH₄⁺-N处理在氮过量时对柳树苗根系形态具有明显的抑制作用，NO₃^--N处理的抑制作用较小。这与Cruz ^[28]和闫慧等^[29]的研究相一致。

CAT大量分布于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，可分解机体代谢过程中产生的活性氧如H₂O₂、O₂^-等，这些物质可对植物体尤其是质膜产生毒害作用，测定CAT的活性可以评价机体受活性氧毒害的程度^[30]。本研究中，旱柳叶片在低氮浓度时NH₄⁺-N处理的CAT活性小于NO₃^--N处理，在高氮浓度时NH₄⁺-N处理的CAT活性大于NO₃^--N处理；旱柳根CAT活性变化趋势则相反，在高氮浓度时NH₄⁺-N处理的CAT活性小于NO₃^--N处理。该结果可能为高氮浓度时NH₄⁺-N对旱柳叶片的毒害作用较明显，而在低氮浓度时NH₄⁺-N对旱柳根系的毒害作用较明显。POD和SOD是植物体内重要的保护酶类。SOD主要功能是催化O₂^-歧化为H₂O₂，使之在植物组织内维持较低浓度，从而消除其对细胞的伤害，SOD活性强弱与植物的抗氧化能力密切相关。POD能催化分解其他底物以消耗H₂O₂，它与SOD相互协调，能有效清除代谢过程产生的活性氧，从而减弱活性氧引起的膜脂过氧化及其它伤害过程^{[19, 31]}。本研究产生的结果，可能是由于进入到植物体的NH₄⁺使其产生有害的过氧化物，而随着氮浓度的增加，植物体内的过氧化物的量也增加，从而使得POD和SOD的活性提高，而过量氮存在时，超过植物自身的解毒能力临界值时，便会产生毒害作用，从而使得POD和SOD的活性在一定程度降低。

MDA是常用的膜脂过氧化指标，植物器官衰老或在逆境下往往发生膜脂过氧化作用，MDA是产物之一，其含量高低表示细胞膜脂过氧化程度的大小和植物对逆境条件耐受的强弱^{[31, 32]}。本研究表明氮不足和过量均不利于旱柳的生长，且NH₄⁺-N的影响大于NO₃^--N。根系活力是指整个根系的代谢状况，其活力大小直接影响植物地上部的生理生化情况，而根部又是植物直接与NH₄⁺接触的部位，很容易受到NH₄⁺毒害^[33]。因此植物的根系活力可以敏感地反映其受NH₄⁺毒害的严重程度。本研究表明同一浓度时，NH₄⁺-N对旱柳根系活力的影响大于NO₃^--N，该结果与Cruz等人^[34]的研究结果相类似。

氮素在植物体内的分布一般集中于生命活动最活跃的部分^[25]。植物对不同形态氮的吸收具有选择性，且当环境条件发生改变时，植物能调节对不同形态的选择性吸收^{[35, 36]}。氮素的不足和过量均会对植物的生长和生理产生影响，而在NH₄⁺-N单一存在时，其不足和过量会对植物根系和叶片产生一定的毒害作用。这主要是由于供给的氮素形态不同，植物的不同器官对其的吸收竞争能力也不一样，由此也可以比较植物的器官需要发挥不同的生理功能，所以对不同形态的氮素竞争吸收量不一样。2种氮处理下，柳树¹⁵N的吸收特性是否与柳树的解剖结构和品种有特异性相关还有待进一步的研究。在柳树应用于水体氮污染修复时，可以适当增加水体NO₃^--N的比例，以此增加柳树对水体氮的吸收去除效果。

致谢：山东滨州一逸林业有限公司总经理焦传礼先生提供实验材料。