人工纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)因为其小尺寸效应、大比表面积等特殊性质被广泛应用,但NPs会通过种种途径进入生态环境中,对生态系统产生潜在危害,因此其生物效应受到广泛关注^{[1, 2, 3]}。纳米氧化锌(ZnO)是应用最广泛的NPs之一,被广泛使用于个人护理产品、化妆品、涂料、抗微生物制剂、电子设备及催化剂等产品中^{[4, 5]}。纳米ZnO能随产品的使用、运输、储存、泄露及废物处理等途径进入水体和土壤等环境^[4]。近期有研究发现,纳米ZnO会产生植物毒性^{[6, 7]}、降低小麦生物量^[8],造成Zn在黄瓜植株体内的过量积累^[9],也可对大豆产生基因毒性^[10],甚至不能产生大豆籽粒^[11],并引起Zn在大豆叶片、籽粒等器官中的积累^[12]。因此,其生物效应和毒性受到广泛重视^{[13, 14, 15]}。

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal,AM)真菌能够与陆地上80%以上的高等植物形成共生体系,是与植物关系最密切的土壤微生物之一^[16]。AM真菌除大量存在于农田等土壤中外,还存在于各逆境环境中,能够提高宿主植物的抗逆性,改善宿主植物的矿质营养(尤其是磷)^{[16, 17]}。纳米ZnO作为潜在的污染物,其与丛枝菌根的相互关系及其对植物生长和营养状况的影响值得深入研究,然而目前尚不清楚。基于此,本试验以常见作物大豆为供试植物,在温室盆栽条件下研究施加不同水平纳米ZnO和接种AM真菌对大豆生长和营养状况的影响,为了解纳米ZnO和丛枝菌根的相互关系提供一些支持。

供试植物为大豆(品种为国审郑196),选用大小形状一致的种子,播种前用温水置于25°C恒温培养箱中浸泡8h。供试AM真菌为Acaulospora mellea ZZ,菌剂基质为河沙,使用前去除宿主植物地上部分,将根剪碎,与含有真菌孢子的基质混匀,风干后作为接种所用菌剂。供试材料为纳米ZnO(粒径(90±10) nm,纯度99.9%)。供试基质为普通河沙,使用前过20目筛,用高温高压蒸汽灭菌法(121°C,1.05kPa)连续灭菌3h后风干备用。

试验设置不接菌处理(-M)和接菌处理(+M),每个处理分别施加不同水平纳米ZnO(0、500、1000、2000、3000 mg/kg),共10个处理,每个处理重复3次。选用230号塑料花盆(上口直径18cm,高12cm),每盆装2kg河沙,基质分装采用逐级混匀的方法施加纳米ZnO。接菌处理每盆按照混施法接种风干菌剂200克,不接菌处理加入等量灭菌菌剂,并浇100 mL过500目筛的菌剂滤液,以保证不接菌处理与接菌处理在其它微生物区系尽量一致。

2013年3月28日播种,每盆均匀播种6颗大豆,深度约2cm,播种后每盆浇500mL水,出苗一周后开始浇1/3强度的Hoagland营养液(其中磷含量为正常含量的50%),之后每7d浇1次,每次100 mL/盆,生长期间按照正常栽培管理措施管理,12周后收获。

大豆植株收获后将植株地上部分和根部分开,先后用自来水、去离子水清洗干净,用吸水纸擦干,再用不锈钢剪刀剪碎后装入信封置烘箱中,105 °C杀青30min后70 °C烘干至恒重,用万分之一电子天平称取干重。选取新鲜毛细根段,用KOH溶液脱色、酸性品红染色,然后用方格交差法测定菌根侵染率。剩余植物样经烘干、研钵磨细、过0.5 mm筛后用H₂SO₄-H₂O₂法消煮,用凯氏定氮仪测定N,钼锑抗比色法测P,原子吸收分光光度计测定Zn、K含量。同时用标准物质以校准测定的准确性。根据植株干重及其元素含量计算植株对此元素的吸收量。

利用Excel 2010和SPSS 16.0等统计软件对数据进行单因素方差分析,Duncun多重比较各处理之间的差异显著性(P<0.05),双因素方差分析纳米ZnO施加水平和接种AM真菌之间的交互作用。

对照处理大豆根系未被AM真菌侵染。接菌处理条件下,未施加纳米ZnO时,大豆根系侵染良好,施加500、1000 mg/kg的纳米ZnO没有抑制菌根侵染,甚至略有刺激作用(图 1)。但在2000、3000 mg/kg时,没有发现菌根侵染或仅有零星侵染(低于1%)。这证明纳米ZnO在施加量500—1000 mg/kg时没有影响菌根侵染能力,高施加量则几乎完全抑制菌根侵染。

图 1 不同纳米ZnO施加水平下大豆菌根侵染率(平均值±标准偏差) Fig.1 Mycorrhizal colonization rate (mean±SD) of soybean plants under different ZnO NPs addition levels a,b不同字母间表示各处理在P＜0.05水平差异显著

图选项

已经证实纳米ZnO具有抗真菌活性^[18]。纳米Ag/Ti能降低向日葵的菌根侵染率^[19]。本研究则发现,高浓度的纳米ZnO对AM真菌也有一定毒性。但NPs剂量与菌根毒性之间的关系可能较为复杂,例如土壤中施加0.032—3.2 mg/kg的纳米FeO、0.01—1 mg/kg的纳米Ag没有降低甚至增加了Glomus caledonium对三叶草的菌根侵染率^[20]。Zn污染较重时一般会对菌根侵染产生抑制作用,但只要宿主植物能够生长,一般不会完全消除菌根侵染,土壤中施加Zn的浓度50—400 mg/kg时没有降低白三叶的菌根侵染率,甚至还随着Zn浓度的增加略有升高^[21]。500—1000 mg/kg的纳米ZnO甚至刺激AM真菌对大豆根系的侵染,而高剂量的纳米ZnO菌根毒性显著,但从图 1看出,纳米ZnO剂量与菌根侵染率之间的关系并非简单的线性关系,可能存在一个临界值,能够对菌根侵染产生抑制甚至致死作用。纳米ZnO的菌根毒性可能与其自身的性质(如粒径)和剂量、植物和AM真菌种类等密切有关,尚需深入探讨。

表 1显示,与不施加纳米ZnO相比,500—2000 mg/kg没有影响植株地上部或根系干重(500 mg/kg接菌处理除外),3000 mg/kg的纳米ZnO显著降低植株干重。有研究证实纳米ZnO具有植物毒性,1000 mg/L的纳米ZnO使黑麦草根尖缩窄,表皮和皮层细胞空泡化甚至崩解,从而降低生物量^[7]。纳米ZnO的植物毒性与粒径有关,甚至强于同等浓度的Zn^2+[22]。随着纳米ZnO浓度(25—100 μg/mL)的升高,洋葱有丝分裂指数降低、染色体畸变指数增加、微核细胞率增加,并伴有膜脂过氧化现象和细胞内化作用^[23]。但土壤中添加500 mg/kg的纳米ZnO甚至略促进大豆植株的生长^[12],说明在土壤环境中纳米ZnO对大豆的植物毒性较弱。本结果证实,2000 mg/kg以下纳米ZnO对大豆生长几乎没有抑制作用,3000 mg/kg时则具有显著植物毒性,但根冠比无显著变化。

接种AM真菌仅在500 mg/kg时显著促进植物生长,在其他水平没有显著作用。胁迫条件下AM真菌对宿主植物的保护作用已经被诸多研究证实^{[17, 24]},但是在沙培或水培条件下,速效营养物质比较充分,其保护效应一般并不显著,此时其促生作用往往通过缓解逆境胁迫来实现。尽管AM真菌在1000 mg/kg侵染良好,其促生作用并没有体现出来。双因素方差分析显示,纳米ZnO施加水平和接菌处理对植株干重有显著交互作用。菌根化三叶草的生长受到高剂量纳米FeO(3.2 mg/kg)的抑制、但高剂量纳米Ag(1 mg/kg)反而促进其生长^[20],这说明不同NPs的毒性与剂量及菌根之间的关系较为复杂,尚需要进一步探讨。

在探讨AM真菌对营养和有害元素的作用时,吸收量比含量更能说明接菌的作用,因为其克服了接菌而引起生物量不一致而造成的影响^[25]。由表 2可以看出,随着纳米ZnO施加水平的增加,植株地上部分和根系N、P、K吸收量在500 mg/kg时最高,在3000 mg/kg时最低。这说明低浓度的纳米ZnO促进植株对N、P、K吸收,但高施加量时,显著抑制对营养元素的吸收。

纳米ZnO颗粒具有粒径小、比表面积大、吸附能力强等NPs的通性,附着在根系表面后聚集在一起,抑制细胞对营养元素吸收,从而影响植物生长^{[7, 14]}。本结果证实高施加量的纳米ZnO抑制了植物营养吸收。纳米ZnO颗粒在黑麦草根部存在吸附并被吸收至内皮层和中柱^[7],可能会影响植物对营养物质的运输。此外,NPs毒性与剂量之间的关系颇为复杂,因为NPs毒性与表面积密切相关,而在大剂量的情况下,NPs可能会凝聚成大的颗粒,反而导致其生物有效性和毒性降低,因此NPs毒性与剂量之间的关系并不总是线性相关^[26],但本研究证实纳米ZnO对大豆生长的影响较为复杂,并非线性负相关。

不施加纳米ZnO时,接种AM真菌显著增加了地上部分和根系P吸收量及地上部分K吸收量,对N吸收量没有显著作用(表 2)。在施加纳米ZnO时,接种AM真菌在500和1000 mg/kg时显著增加P吸收量,但在2000、3000 mg/kg时没有显著作用。接种AM真菌仅在500 mg/kg时增加地上部分N、K吸收量,其他多数情况下降低根系K吸收量。双因素方差分析显示,纳米ZnO施加水平、接种AM真菌及其交互作用对P、K作用较显著,但对N的影响较弱。

在重金属等环境胁迫条件下或贫瘠土壤中,对宿主植物的营养改善作用(尤其是磷)是AM真菌促进植物生长和提高耐性的重要机制之一^{[16, 24]}。某些条件下AM真菌对宿主植物的其他必需营养元素也具有一定的改善作用^[27]。本研究首次证实,在500 mg/kg纳米ZnO条件下,接菌显著促进了大豆生长,并能够改善P、K、N等矿质营养,而在1000 mg/kg纳米ZnO时,接菌虽然没有促生作用,但对P的吸收仍有积极作用。Smith 等^[28]认为,即使接种AM真菌不能促进植物生长,但AM真菌磷吸收途径仍对植物磷总量有重要贡献。在2000、3000 mg/kg时,纳米ZnO对AM真菌毒性显著,这显然是AM真菌未能发挥显著作用的主要原因。

由图 2、图 3可知,随着纳米ZnO施加水平的升高,所有处理植株地上部分和根系Zn含量、Zn吸收量均呈现显著上升趋势,但从2000 mg/kg到3000 mg/kg时,地上部分和根系Zn含量不再增加,Zn吸收量甚至反而降低。有研究发现,水培条件下黑麦草根系Zn含量随纳米ZnO浓度升高而增加,但是地上部分Zn含量很低(仅0.25—1.36 mg/kg),认为纳米ZnO很难被运输到地上部分^[7]。土壤中添加500 mg/kg的纳米ZnO时大豆茎、叶片中的Zn含量分别达126.23、344.07 mg/kg^[12],本结果中大豆地上部分Zn含量与之接近,而且在一定范围内与纳米ZnO施加水平显著正相关,一种原因可能是纳米ZnO易于被大豆植株吸收并转运到地上部分,另一种可能是纳米ZnO易于释放出Zn²⁺,被大豆吸收并转运,也可能二者兼而有之。鉴于纳米ZnO颗粒不易在植物体内迁移,地上部分的Zn很可能是以Zn²⁺的形态被吸收,然后被转运到地上部分。但无论哪种形态,Zn在大豆植株内尤其是地上部分的积累很可能会进入食物链产生一定健康风险。需要利用同位素等试验进一步明确植物体内Zn的形态和来源。

图 2 不同处理对大豆地上部分和根系Zn含量(平均值±标准偏差)的影响 Fig.2 Zn concentration(mean±SD)in shoots and roots of soybean plants under different treatments -M和+M分别表示不接种和接种A. mellea处理； 双因素方差分析结果(F值)：地上部分Zn含量,纳米ZnO F=4.899*,接菌F=89.671* * *,纳米ZnO×接菌F=2.010ns；根系Zn含量,纳米ZnO F=42.708* * *,接菌F=978.383* * *,纳米ZnO×接菌F=5.711* *

图选项

图 3 不同处理对大豆地上部分和根系Zn吸收量(平均值±标准偏差)的影响 Fig.3 Zn uptake(mean±SD)by shoots and roots of soybean plants under different treatments 双因素方差分析结果(F值)：地上部分Zn吸收量,纳米ZnO F=20.104* * *,接菌F=64.188* *,纳米ZnO×接菌F=2.341ns；根系Zn吸收量,纳米ZnO F=6.350*,接菌F=118.386* * *,纳米ZnO×接菌F=0.961ns

图选项

与对照处理相比,纳米ZnO 0水平时,接菌对植株Zn含量和吸收量均没有显著影响,其他施加水平时,接菌降低了根系Zn含量,并在500 mg/kg时增加了地上部分和根系Zn吸收量。Zn是植物必需营养元素,但过多时又能产生毒害作用。一般认为植物体内Zn含量高于400 mg/kg时,就会出现中毒症状。诸多研究表明,在Zn毒害条件下,能够降低植物中Zn含量以减轻其毒害作用,而且往往增加Zn在根系中的分配比例^{[24, 29]}。本研究结果发现,接种AM真菌降低了根系Zn含量,但Zn吸收量反而增加(500 mg/kg),地上部分Zn分配比例也没有显著降低。Jamal等^[30]发现接种AM真菌提高了污染土壤中大豆对Zn的吸收,与本试验结果部分一致。值得关注的是,在2000、3000 mg/kg纳米ZnO时,接种AM真菌没有侵染根系,但对植株Zn含量也有一定影响,这可能是施加的AM真菌菌剂自身对纳米ZnO的化学行为发挥了一定作用,也可能AM真菌前期能与根系共生,但随着时间推移,菌根共生体中的AM真菌被高剂量纳米ZnO致死。因此未来需要研究纳米ZnO存在时菌根侵染的动态变化。双因素方差分析显示,纳米ZnO施加水平和接菌仅对根系Zn含量有显著交互作用,显然纳米ZnO与AM真菌的关系较为复杂,尚需深入研究。

释放Zn²⁺是纳米ZnO的生物毒性机制之一^[31]。有研究发现,1000 mg/L的纳米ZnO溶解释放的Zn²⁺不超过8 mg/L^[7]。纳米ZnO浓度在400mg/L时,释放的Zn²⁺浓度为14.6 mg/L,在4000 mg/L时Zn²⁺浓度为96.9 mg/L^[22]。纳米ZnO的植物毒性甚至强于同等浓度的Zn^2+[22],因此推测纳米ZnO的毒性机制可能有多种。沙培条件下基质中的矿质元素多为自由移动状态,跟水溶液类似。我们把沙培试验中一系列相同含量的纳米ZnO施加于水后,发现其水相中的Zn含量在6 mg/L左右,这证明本试验中的纳米ZnO在水相中具有一定的溶解性,但溶解度较低,而且在500—3000 mg/L浓度范围内并没有显著增加。显然这个Zn含量不可能对植物或AM真菌产生太强的毒害,也不大可能产生急性毒性,纳米ZnO的菌根毒性可能是一个缓慢过程。但纳米ZnO很可能作为Zn²⁺“源”而存在,一旦基质中的Zn²⁺减少(如被植物吸收或者菌根固定),纳米ZnO与Zn²⁺间的平衡被打破,继而向环境中释放Zn²⁺。由于纳米ZnO易于附着在根系表面,结合大豆植株营养状况,推测纳米ZnO抑制根系营养吸收是其对大豆植株和菌根产生毒性的另一个机制。综合当前的研究,NPs对丛枝菌根的宏观、微观影响研究均很少,两方面的作用机制认识都不很透彻,均需要加强研究。

(1) 纳米ZnO在500—1000 mg/kg施加水平时没有影响AM真菌对大豆的侵染能力,但是高施加水平(>2000 mg/kg)时对AM真菌具有一定毒性,几乎完全抑制大豆根系的菌根侵染。

(2) 纳米ZnO在3000 mg/kg显著抑制大豆植株生长,表现出植物毒性,在其他施加水平时没有影响植物生长。

(3) 接种AM真菌仅在500 mg/kg纳米ZnO施加水平时显著促进大豆生长,在其他施加水平下没有显著作用。

(4) 在施加纳米ZnO时,接种AM真菌可以增加大豆对P、K的吸收量,降低根系Zn含量,这可能是AM真菌发挥有益作用的机制之一。

(5) 纳米ZnO可能会持续向外释放Zn²⁺对大豆产生毒害作用,并聚集在根系表面抑制其对营养元素的吸收,进而影响大豆植株营养状况和生长。

致谢： 哈佛大学Cat Adams帮助润色英文摘要,特此感谢。