陆地生态系统包括地上和地下部分两大组分,二者相互作用共同影响生态系统的结构和功能^[1]。一直以来,生态学的主流研究主要集中在生态系统地上部分,并已经有了相当深入的了解,而对于地下生态过程,则了解甚少^[2],如地上部分生物群落如何驱动地下生态过程？地下生物群落又如何反馈于地上生态过程^{[1, 3]}？至今,由于技术与方法等方面的限制,地下生态过程的研究仍停滞不前,在土壤微生物、土壤动物、植物多样性及根系生态方面还有很多难以理解的问题^{[1, 4]}。作为“黑箱”的地下生态过程是生态系统结构、功能与过程研究中最不确定的因素,已成为限制现代生态学发展的“瓶颈”,也严重制约着生态系统与全球变化关系研究的理论拓展^[5]。全球变化的现实,也更迫切地要求生态学家从地下过程的研究中认识陆地生态系统的响应机制^[2]。

随着分子技术的发展,环境DNA技术对于解决地下生态过程中存在的难题提供了一种方便快捷的解决方法,已经在地下生态过程研究中展现出良好的应用前景^{[6, 7]},近几年来,环境DNA技术在土壤微生物多样性^{[8, 9, 10]}、土壤动物多样性^{[11, 12, 13]}、地下植物丰富度及分布^{[14, 15, 16, 17]}、根系生态方面^{[18, 19, 20, 21]}都得到了一定发展和应用。随着生态学研究的深入,将分子技术与传统的生态学研究相结合将成为未来生态学研究的一个发展趋势^[6]。本文主要对环境DNA技术在土壤生物多样性及功能、根系生态方面的应用进行了综述,以期能为复杂的地下生态系统研究提供新的思路和启发。

环境DNA(eDNA)是指由活细胞或有机体产生的细胞DNA和由细胞结构破坏及死亡后产生的细胞外DNA组成^{[22, 23]}。最早(1987年)是由Ogram在沉积物中微生物DNA提取和纯化的研究中提出的概念^[24],但直到2000年之后才被生态学家广泛认可及应用^{[6, 25, 26]}。所谓环境DNA技术,是指从土壤、水体及沉积物等环境样品中直接提取DNA片段,然后通过DNA测序技术(如Sanger双脱氧链终止法；化学裂解法；新一代测序技术(NGS)等)来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征^{[27, 28]}。

目前常见的分子技术主要有：基于PCR 的构建克隆文库方法、变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE) 、随机引物扩增多态性分析(RAPD) 、限制性片段长度多态性(RFLP)、末端限制性片段长度多态性(T-RFLP) 、荧光原位杂交(FISH)、宏基因组学(Metagenome)及宏转录组学(Metatranscriptomics)等^{[6, 7, 17, 29, 30, 31, 32]}。尤其是基于低成本、高通量测序平台(目前以Illumina 公司的Solexa,ABI 公司的SOLid,和Roche 公司的454 技术应用最为广泛)的新一代测序及基因芯片技术的出现,不仅克服了Sanger测序等方法,在克隆及PCR扩增产物测序的耗时,费用昂贵等缺点,而且具有从同一个样品中同时分析测序多种基因的优点,使得复杂环境样品的基因组分析已经成为生态学研究中的重要方法与手段^{[17, 29, 31, 32, 33, 34]}。基于DNA的分子技术方法,对于理解物种进化、生态系统演替、生态系统的结构和功能、及生态多样性等研究将具有重要的推动作用；尤其是对于作为“黑箱”处理的地下生态系统来说,将具有革命性意义,对地下生物组成、生物多样性、地下生态系统结构和功能等认识和理解将具有十分广阔的应用前景^{[6, 7, 30, 31]}。

土壤微生物是土壤生物中的一个重要类群,其群落结构、多样性及动态过程是气候和土壤环境条件变化的敏感指标,在物质合成、降解、碳氮等元素地球化学循环方面具有十分重要的生态功能。土壤微生物多样性主要研究土壤环境中微生物种群的种类、丰度、分布均匀性、结构变化和微生物群落的功能多样性等。但人类对微生物物种的了解非常有限,Cowan等指出只有20万种微生物可以用人工的方法进行纯培养,只占整个自然界微生物物种总数的1%—10%,远远低于微生物实际的多样性程度^{[35, 36]}。20世纪90年代,随着分子生物学技术的发展,特别是16S rRNA 基因序列在分子系统学上的应用,许多研究者试图避开微生物的培养工序而从分子水平上了解和确认自然环境中存在的微生物,及其在土壤生态系统中的结构和功能。目前,大多数环境DNA技术在土壤微生物多样性及生态功能方面都得到了应用^{[6, 7, 29, 30, 31]}。如有些研究通过16S rDNA 序列分析法分析了土壤细菌多样性^{[9, 10]},结果说明土壤的农业耕作可显著影响细菌和古生菌的多样性。He等分别利用16S和18S rRNA 基因调查了澳大利亚两种针叶林土壤中细菌和真菌群落组成及多样性^{[37, 38]}。随着宏基因组和宏转录组概念的提出、新一代高通量测序技术及基因芯片的应用,微生物宏基因组学和宏转录组学逐渐成为微生物研究的热点和前沿。Buée等利用第二代测序技术(454焦磷酸测序) 对6种森林类型土壤真菌进行调查,结果表明,不同植被类型森林土壤中存在极高的真菌生物多样性,可有效探究真菌群落随环境变化的精细结构^[39]。Blaalid等采用454扩增产物测序方法研究了不同演替梯度下草本植物珠芽蓼(Bistorta vivipara)共生菌根真菌群落特征,菌根真菌多样性随着演替梯度的变化显著增加^[40]。这些结果体现了高效的454测序技术在研究地下生态系统真菌群落时空动态过程中的有效应用。

宏基因组学技术不仅应用在土壤微生物多样性方面的研究,也逐渐用来揭示微生物参与土壤生态过程等功能方面的探讨。如Zhou等基于功能基因芯片技术,研究了土壤长期增温后微生物对土壤有机碳稳定性的影响,结果表明,在增温条件下,分解易降解有机碳的基因变得活跃,而分解难降解有机碳的基因并没有显著改变,这表明土壤有机碳库主体相对稳定^[41]。He等通过功能基因芯片技术,研究CO₂浓度升高的效应,发现碳固定基因、易降解碳基因以及氮循环基因的数量明显增多,活性增加,表明土壤微生物参与这3种生态过程的功能增强^[42]。Mackelprang等基于454测序技术调查了高寒条件下土壤微生物的群落变化,研究发现,当永久冻土随气温升高而融化时,微生物群落的碳氮循环功能基因的活化,与永久冻土里甲烷释放等现象存在相关性^[43]。而宏转录组学是从整体水平上研究特定环境、特定时期群体细胞中所有RNA(包括mRNA 和非编码RNA) 的转录情况及转录调控规律。因其测序量小,发现新基因能力强,同时可对微生物群落结构和原位功能进行解释,比宏基因组学技术更为有效地监控由环境引起的群落结构和功能的变化^{[44, 45]}。这种技术在土壤微生物结构和功能的研究中也得到了初步应用。如Leininger等人通过cDNA 的高通量测序及数据库比较分析对欧洲12个不同土壤类型样品进行了研究,发现泉古菌很可能是土壤生态系统中丰度最高的胺氧化生物群体^[46]。而Urich等人采用宏转录组和宏基因组两种方法,结合SEED数据库及MEGAN程序,对沙质土壤生态系统微生物群落的结构和功能特征进行研究,同样发现泉古菌对土壤氨氧化和CO₂固定过程起重要作用,而宏转录组比宏基因组更为有效地检测微生物群落结构变化的过程^[45]。

宏基因组及宏转录组技术在土壤微生物生态功能方面的研究具有良好的应用效果,但这些研究仅仅从分子生态学中微生物功能基因的微观角度来阐述其生态功能,并未结合宏观尺度的碳、氮循环过程,所以,其研究结果可能与实际状况有所偏差。如何将分子水平上的功能基因变化与生态系统水平上有机碳分解、氮循环过程的具体观测数据结合起来分析,如何将微观尺度上的研究结果推绎到宏观尺度是现代生态学发展亟待解决的问题。总之,宏基因组和宏转录组技术因其可以结合生物信息学及环境因子进行数据综合分析,能够揭示微生物与环境之间的生态过程,为从群落结构及生态系统尺度上认识微生物的生态过程与功能开拓了新的途径。

土壤动物是构成陆地生态系统的重要组成部分,土壤动物协同相关的微生物有机体共同调节着生态系统的过程和功能,直接或间接影响有机质分解、养分循环、碳获取、植物群落动态及土壤结构维持等过程,近年来土壤动物生态学研究已经成为生态学、地学领域研究的热点和前沿^[47]。目前土壤动物的研究主要集中在土壤动物多样性方面的研究。尽管土壤中存在多种多样的动物种类,但对不同尺度范围内土壤动物多样性的分布模式及影响因素知之甚少^[48]。这种信息的缺失主要是由于缺乏快速、便利、精确地测定土壤动物多样性方法^[49]。目前用于土壤动物多样性的研究方法主要是传统的形态学鉴定方法,这种传统方法要求研究者必须较好地掌握每一种动物类群的特征,而且工作量较大^[50]；另外,由于不同类群的土壤动物其个体大小及生态史各不相同,因此提取不同类群的土壤动物往往需要不同的方法,这必然会影响到人们对同一土壤样品中所有动物种类的鉴别,往往会忽略很多土壤动物类群的识别^[49]。

基于DNA技术的分子生物学方法,如变形梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性、及磷脂脂肪酸分析等,可以快速地从单一土壤样品中鉴别出土壤动物的物种多样性^{[11, 51]},如Huang等利用标准线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)基因区位作为DNA条形码,对中国6个属28个种的蚯蚓种群的基因多样性进行了研究,结果表明基因序列的种内趋异性通常低于1%,而种间趋异性高于15%,认为利用DNA条形码技术能够准确的区分28个蚯蚓种群类别,同时也可能区分一些未确认边缘种或亚种,是一种蚯蚓种群区分及多样性测定的重要方法,有效弥补了传统形态学分类方法的不足^[52]。Wu等采用18S rDNA基因片段作为特异性引物,对土壤样品中DNA进行分子扩增及测序,与土壤动物基因库进行对比来鉴别北方森林及极地苔原生态系统中土壤动物种类及丰富度^[11]。Bienert等利用DNA元条码与新一代测序技术相结合的方法分析了法国阿尔卑斯山地生态系统土壤中蚯蚓的物种组成,通过提取14种蚯蚓线粒体DNA(mtDNA)16S基因,创建DNA参照数据库,设计两个DNA序列较短(只有30—70bp)的特异性引物进行PCR扩增及测序,并认为通过这种土壤中DNA测定可以区分多种生态系统或样点的蚯蚓群落特征^[13]。Wu等人通过分析收集到的17516个环境18S rRNA基因序列,研究了全球11个不同生物区系和不同纬度的区域中20个门土壤动物多样性的分布特征及影响因素^[12]。与传统的形态学分析相比,环境DNA技术可以快速分析土壤动物的多样性及其分布特征,可以更有效地鉴定到未知的或稀少的物种,因此鉴定土壤动物类群的幅度较宽,同时可以进行时空尺度上的对比研究。

目前,环境DNA技术主要用在土壤动物鉴别分类、物种多样性及空间分布方面的研究,而有关土壤动物生态功能方面的研究很少有报道。如何借鉴土壤微生物生态功能方面的研究经验来推动土壤动物生态功能的研究是未来土壤动物生态学发展的一个重要环节。

目前,对植物多样性及群落组成的研究完全是基于植物地上部分的数据,依赖于个体植物的生物量、丰度、以及形态分类鉴定,这种方法往往耗时费力,尤其是在森林生态系统中；而且由于不同植物的生活史不同,以及植物休眠等因素,在生长季不同时间进行植物多样性测定的结果往往存在较大偏差^[53],因此,应用传统方法进行植物多样性及群落组成调查需要在生长季中进行多次采样,大大增加了工作量。另外,由于在调查过程中很容易导致某些物种的遗漏,很难定量化物种入侵早期或灭绝后期的物种定植或灭绝的动态变化量^{[54, 55]}。研究者越来越意识到传统的调查方法对植物多样性及群落组成测定存在的问题。环境DNA技术可以克服这些问题,土壤中的DNA信息可以有效补充地上部分的调查数据。事实上DNA在土壤中可以存在较长时间,土壤样品采集不用局限于植物生长季,因此,在野外取样具有较大灵活性,降低了误判的可能性^{[17, 33]}。

近几年,少数国外分子生物家逐渐通过环境DNA技术对不同生态系统的植物分类及多样性进行了研究。如Yoccoz等采用元条码(metabarcoding)方法,从土壤中提取DNA,用带有标记的g和h引物来扩繁质体DNA trnL(UAA)内含子,对欧洲3个气候类型区的植物进行分类,并对植物多样性进行调查,结果发现通过土壤DNA分析所得到的植物种类和多样性与通过地上部分形态学调查所得到的结果高度一致,这种方法在热带及温带地区同样有较好的适用性^[17]。而Hiiesalu通过新一代测序技术(叶绿体DNA trnL(UAA)内含子的454测序)研究草本植物地下植物丰度水平,并与地上部分的丰度相比较,结果发现在区域尺度内,植物地下丰度可以达到地上部分的两倍,在群落水平上,地下丰度同样超过地上部分；地上部分丰度随土壤肥力增加而下降,而地下部分所发现的物种数量则随土壤肥力增加而显著增加^[33]。这表明传统的地上部分植物丰度的研究可能忽略了许多共存的物种,在地上部分丰度下降的条件下,地下丰度研究可能更有意义。基于DNA技术的物种丰度研究方法,改变了人们以往对植物群落多样性模式的理解,将揭示一些与以往地上部分丰度描述不一样的模式,能够产生有关植物群落结构和功能方面的新想法^[16]。

细根是陆地生态系统中最重要的,也是最难研究的领域^{[5, 56, 57]}。而不同植物细根的精确识别是根系研究中最困难的环节。如何快速有效地区分不同植物的细根,提高细根研究数据的精确性是所有根系生态研究者所面临的难题。随着分子生物学的发展,环境DNA技术开始被研究者用来研究植物根系,应用到根系的鉴定与识别^{[58, 59, 60, 61]}。Bobowski等采用叶绿体rbcL基因限制性片段长度多态性(RFLP)方法,能够准确区分美国西部9种木本植物的根系^[62]。Jackson等和Linder等利用核核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列,成功识别了美国得克萨斯州的7种木本植物根系^{[58, 59]},这些研究表明,在根系鉴定与识别研究中,分子生物学技术具有很大的应用潜力。目前,已有研究者尝试以环境DNA技术来定量化细根的生物量大小,探讨细根空间分布规律^[19]。如Ugawa等从土壤中提取DNA,结合实时PCR法,发现玉米根系生物量与土壤中DNA含量之间表现出极显著的相关性,表明可以采用环境DNA技术有效测定根系生物量,但会受到土壤类型的限制^[21]。Riley等也利用实时PCR方法对土壤中根系的数量进行了定量化研究,该研究认为分子生物学方法比较灵敏,可以在混合样品中定量化目标样品,能够精确探测到土壤中的低根系含量(根量<2 mg/kg干土重)^[63]。这种分子技术为土壤中根系研究提供了新方法,根系DNA的定量化分析为植物根系生态功能和生态过程提供了新视角。

部分研究对根系DNA的提取方法、提取效果及影响因素进行了探讨。如Brunner等改进了木本植物细根识别的分子生物学方法,在DNA提取过程中,添加2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和5% 聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)固定多酚类化合物,然后进行PCR扩增及分子测序工作,准确快速地鉴定出阿尔卑斯山中30种树木的根系^[64]；Haling等人采用3种DNA提取技术(PowerSoil 0.25 g DNA提取试剂盒；Purdy修改的苯酚提取法；SARDI分子诊断提供的商业DNA提取技术)对草本植物根系生物量进行了对比研究,结果表明细根生物量与土壤DNA含量之间存在显著的相关性,3种DNA提取方法都具有较好的提取效果^[18]。在这个研究中,Haling同时分析了土壤类型、植物材料、净根提取、根系冷藏保存、植物年龄、物种组成、及根系构型等多种因子对根系DNA提取的影响。Fisk等采用叶绿体trnL内含子的PCR扩增子(限制性片段长度多态性)研究了美国北方硬阔叶林中美国山毛榉(Fagus grandifolia Ehrh.)、黄桦(Betula alleghaniensis Britton)和白蜡(Fraxinus americana L.)3个树种细根的根群组成,并探讨了根系种类、相对丰度和细根直径对根系DNA提取的影响,分析认为该方法可以有效地测定不同树种细根的含量及丰度,但不同树种之间存在差异,混合样品中根系含量多的物种DNA回收效率较低,直径<0.3 mm的细根样品中DNA的回收效率大于直径>0.3 mm的细根^[65]。Taggart等采用trnL内含子和trnT-trnL以及trnL-trnF基因间区3种荧光标记的PCR扩增子(荧光片段长度多态性)研究了不同的羊茅草原群落的物种组成,并区分各物种的根系,结果表明叶绿体trnT-trnL具有较低扩增成功率,而trnL内含子和trnL-trnF基因间隔区可以区分超过80％的物种,也可有效区分82%的植物根系^[66]。

环境DNA技术在复杂的根系生态学研究中具有明显的优点。分子技术能够精确地鉴别单个物种^[58],甚至单个植物的根系^[64],特别是针对细根研究。细根是植物竞争及根系对异质性的土壤环境反应的主体,但却很难从土壤中分离出来,不同植物种类细根难以用形态学方法进行鉴定与识别。环境DNA技术是直接从土壤样品中提取根系DNA,克服了传统方法需要洗根、分根、只能测定单物种根系的局限^{[64, 65]},可以降低由于洗根造成细根损失而带来的研究误差。随着环境DNA技术的发展,以分子生物学手段定量化研究根系生物量、根系与环境之间的相互作用规律将是根系生态学新的发展方向。

环境DNA技术在土壤微生物多样性研究方面相对成熟,许多分子生态学家及微生物学家在土壤微生物研究中广泛应用环境DNA技术,但在土壤微生物和土壤动物的生态功能方面、植物地下多样性及根系生态学研究中的应用相对较弱。宏基因组和宏转录组技术的发展及应用使土壤生物生态功能的研究成为可能,目前,有关土壤生物生态功能的研究处于初级探索性阶段,也仅仅通过土壤微生物群落功能基因的变化来初步预测其功能作用,而并未将功能基因的变化与生态系统水平上的生态过程及功能联系起来。因此,未来在利用宏基因组学和宏转录组学进行微生物生态学研究时,有必要充分结合生态学尤其是群落生态学和生态系统生态学的相关理论和方法,将微观尺度的生态学规律推绎到中观尺度的生态系统,及至宏观尺度的全球生态系统,这种研究尺度的推绎是分子生态学的研究结论得到普适性应用的关键,也是一个研究难点。为此,可以沿着一系列环境梯度,如温度、降水,进行土壤宏基因组学和宏转录组学的调查,有助于揭示环境因子乃至气候变化对土壤微生物、土壤动物的影响以及地下生物对此做出的响应,从而探讨区域或全球尺度下的生态环境问题。在清楚分析宏基因组中碳、氮循环功能基因(如参与甲烷代谢的基因、硝化/反硝化相关基因)比例及其变化的基础上,结合生态系统尺度上的碳、氮循环的数量,来探讨土壤微生物、土壤动物在相对宏观尺度上对碳、氮循环库和流的贡献应该更具有实际意义。

除了植物丰度、多样性及物种组成外,基于DNA技术的植物地下部分研究还可应用于其它领域,如沿环境梯度变化物种的分布特征、共存的根系与根际区分、植物群落地下配置规律、植物行为生态,如不同种或不同基因型植物是否会指示地下根系对向生长或者彼此远离生长,为什么会出现这种行为？这种方法还可以用于植物根系的生长状况,如植物根系和根际能延伸多远、能休眠多长时间、哪些物种可以共存？也可用于研究植物与微生物竞争土壤养分的研究。这些领域中有许多无法回答的生态学问题,需要借助分子生物学手段来进行合理解答。总之,环境DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程的研究将具有革命性意义,在对地下生态系统结构和功能等认识和理解过程中将具有十分广阔的应用前景,也是对作为“黑箱”的地下生态系统进行拓展研究的关键技术手段。相信在未来一段时期内,随着环境DNA技术的不断发展与完善,地下生态过程的研究将会取得丰硕的成果。