作为土壤中一类重要的化合物，氨基酸占土壤中全氮的15%—60%^[1]，是土壤氮素循环和作物养分供给过程中重要的“库”和“源”，可通过矿化作用提供可利用氮源来不断地满足作物氮素营养的需求^[2]，也可以被植物直接吸收利用；同时它还是一种植物生长调节剂，作为前体通过土壤微生物代谢途径合成植物生长激素，进而刺激植物生长，调节植物生理过程^[3]；此外，它也是微生物重要的营养源之一，对土壤微生物群落结构、数量和活性均有直接影响。氨基酸是土壤微生物、植物及环境因子交互作用的平衡产物，研究土壤中氨基酸的组分及含量变化规律，对研究土壤中氮的来源及转化，及其对作物生理生态变化的影响均有重要的实际意义。因而，国外学者在土壤氨基酸的研究方面做了不少工作，但是主要集中在环境、气候、耕作方式、施肥方式、作物等因素对土壤中氨基酸组成和含量的影响方面^{[4, 5, 6, 7]}，很少有研究涉及到土壤动物特别是蚯蚓对土壤氨基酸的影响。据研究，蚯蚓对土壤肥力以及土壤生物学性质均有着明显的改善作用^[8]，并能够促进植物养分吸收和生长发育^[9]，通过其掘穴、排粪、搅动及其他活动可以明显改变土壤理化性质，改变土壤生物群落结构，从而影响土壤养分循环^{[10, 11]}；被誉为是土壤生态系统工程师的蚯蚓在土壤生态系统中起着重要且不可替代的作用^{[12, 13, 14]}。鉴于此，本文中采取赤子爱胜蚓(寡毛目正蚓科爱胜蚓属，食碎屑类表栖型蚯蚓)和威廉环毛蚓(寡毛目巨蚓科环毛蚓属，食土类深栖型蚯蚓)两种不同生活型的蚯蚓作用于土壤后，利用氨基酸分析仪详细测定了被作用土壤酸解氨基酸及游离氨基酸的组分及含量的变化，同时对比分析了两种蚯蚓间作用效果的异同，为进一步揭示蚯蚓的生态功能机理和开发利用提供理论依据。

(1)供试土壤 土壤于采自江苏省南京市江宁区麒麟门菜地(N 32°05′,E 118°93′)，土壤类型为黄棕壤，采样深度为0—20 cm。本地块长期(10a以上)施用以猪粪为主的农家肥，种植作物为白菜、生菜、辣椒和番茄等蔬菜。土壤基本养分性质为：有机碳含量为 26.9 g/kg，全氮 2.3 g/kg，全磷1.5 g/kg，速效磷182.7 mg/kg。

(2)供试蚯蚓 本实验使用赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)(食碎屑型)和威廉环毛蚓(Metaphire guillelmi)(食土型)两种不同生活型蚯蚓。赤子爱胜蚓购自江苏省南京市江北某蚯蚓养殖场，威廉环毛蚓采自江苏省南京市麒麟门菜地。所有供试蚯蚓均要经过筛选，必须为有环带的成年蚓，赤子爱胜蚓的体重控制在0.21—0.32 g，威廉环毛蚓体重控制在4.34—5.86 g。蚯蚓采集后，经过纯净水洗净后在黄棕壤土中养殖一周。

(3)培养容器 圆柱形半透明塑料容器(底径10 cm×高12.4 cm)，其下端密封，上端在加入蚯蚓后用透气膜封口。

本试验于南京农业大学土壤生态实验室进行，共设置3个处理，每个处理4个重复。① CK：500.0 g供试土壤，不加蚯蚓。② EE：500.0 g供试土壤，加赤子爱胜蚓(80条，平均体重0.25 g，共20g)。③ EM：500.0 g供试土壤，加威廉环毛蚓(4条，平均体重5 g，共20g)。两种生活型蚯蚓添加的总生物量保持一致，加入蚯蚓后，盆钵内蚯蚓密度为采样地区蚯蚓密度的2倍(养殖场和菜地中蚯蚓密度都比较高，室内培养试验设计时又将密度提高了1倍)。

将供试土壤均匀置于12个塑料培养容器中，每个容器内装入500.0 g。调整每个容器内容物的含水量为30%后将容器放置于暗处预培养3d。3d后，按照上述试验设计在每个容器中加入相应的蚯蚓。所有处理蚯蚓添加完成后用透气膜封口以防止蚯蚓逃逸(膜上用大头针刺空以保证空气交换)。最后将处理好的容器放在(22±0.5)℃的暗处，培养30d。在培养时，每隔两天用补重法为每个处理补水以保持土壤的含水量稳定。培养结束后，每个处理破坏性采样，手工挑出蚯蚓和蚯蚓茧(只有赤子爱胜蚓处理有蚓茧)后将容器内剩余土壤混匀并储存在-20℃冰箱内，以供测定分析。

(1)土壤氨基酸测定 采用最常用的酸解法分析^[15]，具体如下：土壤采集后，风干混匀后并将部分土样研细，过2 mm筛后用以测定氨基酸含量。准确称取土壤2.0 g，加入10 mL盐酸(6 mol/L)，在110℃下封管水解20 h后取出冷却，将水解液过滤到蒸发皿中，并用少量蒸馏水多次淋洗残渣，随后，在水浴锅(40—50℃)上干燥滤液，干燥后的残留物用2—3 mL去离子水溶解，蒸干。如此重复进行2—3次，使HCl完全挥发，最后一次蒸干后，用pH 2.2的缓冲液溶解定容后，经H型酸性阴离子交换树脂柱纯化，用氨基酸分析仪测定各种氨基酸的组分和含量。

(2)土壤游离氨基酸测定 准确称取土样10 g于100 mL离心管中，加入40 mL纯净水，混匀。在20℃条件下，摇床中震荡2h，转速为200 r/min。然后在4500 r/min转速下离心20 min后取上清液过0.45 μm滤膜后备用。将制备好的DOM置于蒸发皿上在50℃烘箱中蒸干。用1. 5 mL纯净水溶解蒸干的残渣，加4mL氯仿，混匀，将液体倒入离心管中，再用2 mL氯仿冲洗蒸发皿2次。3000 r/min离心20 min，小心吸取上清液1 mL于1.5 mL离心管中4℃冰箱保存，用氨基酸分析仪测定各种氨基酸的组分和含量^[16]。

采用 SPSS软件进行数据分析，采用单因素方差分析评价处理之间的显著差异，采用最小显著极差法(LSD)进行平均值多重比较。

在培养期结束时，所有处理中两种生活型蚯蚓生物量和数量均无显著变化。爱胜蚓和环毛蚓生物量生物量分别下降3%和6%；两种蚯蚓数量在整个培养过程中均无变化。

接种蚯蚓可显著提高土壤酸解氨基酸的总含量，和对照相比，EE和EM处理中酸解氨基酸总含量分别提高了5.07 g/kg和3.86 g/kg(图 1)。爱胜蚓对土壤酸解氨基酸总量的提升效果明显强于环毛蚓。

图1 蚯蚓活动对土壤酸解氨基酸及游离氨基酸总量的影响 Fig.1 Effects of earthworm on acidic hydrolyzable amino acid and free amino acid in soil CK: 不加蚯蚓； EE: 加赤子爱胜蚓; EM: 加威廉环毛蚓；图中不同小写字母表示处理间差异在P <0.05水平显著

图选项

氨基酸可以分为酸性、碱性、中性和含硫氨基酸等4类(表 1)。其中，中性氨基酸为优势组分、所占比例最高，在S、EE和EM处理中，中性氨基酸分别占各自氨基酸总量的55.4%、50.5%和49.9%；碱性氨基酸含量最少，在上述处理中分别占各自氨基酸总量的10.2%、10.2%和10.8%。4类氨基酸在蚯蚓作用后的含量相对于对照均有增加，EE处理酸性、碱性、中性和含硫氨基酸含量分别增加1.39、0.52、2.19 g/kg和0.97 g/kg；EM处理中分别增加0.79、0.46、1.5 g/kg和1.11 g/kg。对比两种不同生活型蚯蚓作用效果可知，爱胜蚓对土壤酸性、碱性、中性3类氨基酸的提升效果均强于环毛蚓。

蚯蚓活动并未改变土壤酸解氨基酸的种类组成，S、EE和EM处理土壤中可检测出的酸解氨基酸种类均为16种(表 1)。S处理中以谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸为主，这4种氨基酸的含量总和占土壤中酸解氨基酸总量的40.8%。蚯蚓活动改变了土壤酸解氨基酸的优势组分，EE和EM处理中优势氨基酸组分为谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，其总和分别占土壤中酸解氨基酸总量的43.6%和43.1%，和对照相比甲硫氨酸取代半胱氨酸成为优势组分。3个处理土壤中酸解氨基酸含量最高和最低组分相同，分别为谷氨酸和精氨酸。

蚯蚓活动可以明显改变土壤酸解氨基酸各个组分的含量。土壤中接种爱胜蚓以后，共有15种氨基酸含量显著提高，增幅较大的组分为甲硫氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸和赖氨酸，增幅均在85.7%以上，其中甲硫氨酸增幅高达373.3%；缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苏氨酸、组氨酸及丝氨酸增幅适中，在40.7%—62.7%之间；增幅最小的为异亮氨酸和苯丙氨酸，分别为39.2%和27.8%；而半胱氨酸在爱胜蚓作用下显著下降0.15g/kg，下降幅度达25.4%。环毛蚓作用下，共有14种土壤酸解氨基酸显著升高，其中甲硫氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和丙氨酸增幅较大，均在71.9%以上，甲硫氨酸增幅更高达403.3%；甘氨酸、精氨酸、异亮氨酸增幅适中，分别为56.8%、55.6%和54.9%；丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸和苯丙氨酸增幅最小，均在40%以下，其中苯丙氨酸增幅只有16.5%；缬氨酸和半胱氨酸在环毛蚓作用下分别降低0.04 g/kg和0.11 g/kg(缬氨酸下降水平未达显著)。

两种不同生活型蚯蚓作用土壤后，氨基酸组分含量的变化趋势是相同的(缬氨酸除外)，但是两种蚯蚓的作用的强弱程度却存在一定差异。环毛蚓对甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和赖氨酸的作用效果显著优于赤子爱胜蚓的作用效果；而对于其他11种组分，爱胜蚓的作用效果更佳。

土壤游离氨基酸总量在蚯蚓作用下显著提高(图 1)，S、EE和EM处理游离氨基酸总含量分别为8.56、16.28 mg/kg和13.00 mg/kg，爱胜蚓和环毛蚓分别使土壤游离氨基酸含量提高90.1%和51.9%。对比两种不同生活型蚯蚓作用效果可知，爱胜蚓作用效果显著高于环毛蚓。

四类氨基酸里所占比例最高的为中性氨基酸，S、EE和EM处理比例分别为50.7%、55.0%和57.5%；碱性氨基酸含量最少，3个处理比例分别为3.2%、13.3%和4.6%。酸性、碱性和中性氨基酸在蚯蚓作用后显著增加，爱胜蚓和环毛蚓分别使酸性、碱性、中性氨基酸显著增加1.32 mg/kg和1.17 mg/kg，1.85 mg/kg和0.29 mg/kg，4.61 mg/kg和3.14 mg/kg；而含硫氨基酸含量在两种蚯蚓作用下分别减少0.06 mg/kg和0.16 mg/kg，但差异未达显著水平。对比两种不同生活型蚯蚓作用效果可知，爱胜蚓作用效果略强。

根据表 2结果可知，土壤可检测出的游离氨基酸种类较酸解氨基酸少，3个处理都只能检测出14种，酪氨酸和赖氨酸并未检出。两种生活型蚯蚓并未改变土壤游离氨基酸的种类。S、EE和EM 3个处理中优势氨基酸组分均为半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸，这4种氨基酸的含量总和分别占各自土壤游离氨基酸总量的62.0%、47.2%和56.9%。3个处理土壤中游离氨基酸含量最高的组分分别为半胱氨酸、谷氨酸和丝氨酸，含量分别为1.69、2.35 mg/kg和2.42 mg/kg。含量最少的组分均为异亮氨酸。

和对照相比，接种蚯蚓后土壤游离氨基酸各个组分含量发生明显改变。土壤游离氨基酸在爱胜蚓作用下共有13种组分升高(除甲硫氨酸外差异均达显著)，其中组氨酸、精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸提高幅度较大，均在150.0%以上，尤其以组氨酸增幅最高为793.3%；天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸增幅较为平缓，介于58.8%—92.1%之间；增幅最小的是甲硫氨酸，仅增加4.4%；而半胱氨酸在爱胜蚓作用下降低0.07mg/kg，但其差异未达显著水平。环毛蚓作用下，同样有13种氨基酸升高(除丙氨酸和甲硫氨酸外差异均达显著)，其中天冬氨酸、精氨酸、丝氨酸和异亮氨酸增幅最大，分别为184.2%、173.3%、163.0%和116.6%；苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸和甘氨酸增幅较缓，介于52.3%—92.7%之间；谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸增幅较低，均在33.1%之下，其中甲硫氨酸增幅仅为11.1%；而半胱氨酸在蚯蚓作用下显著降低，降幅为11.8%。

对比两种生活型蚯蚓作用效果可知，氨基酸各组分含量在爱胜蚓和环毛蚓作用下的增加或减少趋势相同，但幅度却存在明显差异。天冬氨酸和丝氨酸在环毛蚓作用下增加幅度较大，和爱胜蚓相比，两种氨基酸分别多增加92.1%和85.9%；谷氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸则是在爱胜蚓的作用下增加效果更强；两种蚯蚓对苏氨酸的增加效果差异未达显著水平；而半胱氨酸的减少效果以环毛蚓更大。

氨基酸是土壤生态系统中最为重要的化合物之一，它是土壤有机氮的重要组成部分，是植物和土壤微生物的重要营养源，并直接影响着土壤肥力和供氮能力，在土壤营养循环过程中占据着重要的位置^{[3, 17]}。土壤中的氨基酸主要来源于微生物、动植物及其代谢产物，如土壤有机质的降解，动植物的分泌或微生物的合成^[17]，其数量大小取决于气候、凋落物、植被、土壤类型、土壤动物和耕作方式等多种因素的综合作用^[18]，而蚯蚓也是影响土壤氨基酸的因素之一。本文研究结果表明，蚯蚓活动可以显著增加土壤酸解氨基酸和游离氨基酸的含量，造成这个结果的原因可能有以下几个方面：(1)蚯蚓体主要由蛋白质组成，接种的蚯蚓为土壤生态系统引入大量蛋白质，而蚯蚓死亡分解后会导致土壤氨基酸的增加(本文中蚯蚓未死亡，但生物量降低导致土壤系统中蛋白质含量增加)；(2)蚯蚓活动会分泌大量的胶粘物质，通过代谢进入土壤中，这些代谢物质中含有大量可溶性氨基酸^[19]，导致土壤氨基酸含量增加；(3)氨基酸是微生物可以直接利用的氮源之一，同时又是微生物合成的产物，微生物在消耗氨基酸的同时又在生成氨基酸，而蚯蚓可以通过改变微生物群落、数量和活性间接对土壤氨基酸产生影响^[20]；(4)凋落物的分解和植物根系分泌是土壤氨基酸的直接来源，蚯蚓通过挖掘、吞食等活动可以加强凋落物分解和植物根系分泌氨基酸的能力，从而间接增加土壤氨基酸含量；(5)蚯蚓可以通过分泌、代谢等途径改变土壤的pH、DOC含量及碳水化合物含量，从而间接改变土壤氨基酸的含量^[21]。

游离氨基酸是存在于土壤溶液和空隙中以可溶性游离状态存在的氨基酸，虽然含量微小，但周转快，通量大，可被植物和微生物直接利用，因而在土壤养分循环过程中起着极其重要的作用^[22]。本研究发现，土壤游离氨基酸总含量在两种生活型蚯蚓作用下分别提高90.2%和51.9%，和酸解氨基酸总量的提升幅度相比，提升幅度提高24.7%和2.1%，这说明蚯蚓活动不仅提高了土壤中氨基酸的总量，更提高了游离氨基酸在土壤总氨基酸中所占比例，这对增加土壤可利用氮通量，提高微生物和植物的氮利用率均有积极作用，在一定程度上，揭示了蚯蚓活动促进植物生长和提升土壤微生物活性和数量的内在原因。

S、EE和EM处理土壤酸解氨基酸以中性氨基酸含量为最高，酸性氨基酸次之，而含硫氨基酸及碱性氨基酸最少。这与自然条件下土壤氨基酸比例相似，陈水挟等的研究表明，我国闽北各种类型土壤均以中性氨基酸为主，占氨基酸总量的60%—75%，酸性氨基酸次之(20%—40%)，而碱性和含硫氨基酸最少。这说明，蚯蚓活动并未改变土壤中酸性、中性、碱性和含硫氨基酸组分的比例，而是以相似的比率均衡提升了4种类型氨基酸的含量。土壤酸解氨基酸的优势组分在蚯蚓作用下发生明显改变，处理后的土壤酸解氨基酸优势组分由谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸转变为谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，和对照相比甲硫氨酸取代半胱氨酸成为优势组分之一。甲硫氨酸与生物体内各种含硫化合物的代谢密切相关，是体内活性甲基和硫的主要来源，土壤生态系统中接种大量的蚯蚓后，蚯蚓生物的降低和代谢活动的急剧增强可能是甲硫氨酸显著增加的原因，具体途径有待进一步研究。

研究结果表明，两种不同生活型蚯蚓均可对土壤氨基酸产生影响，土壤氨基酸总含量及各组分含量在爱胜蚓和环毛蚓作用下的增加或减少趋势相同(土壤酸解氨基酸组分缬氨酸除外)，但改变幅度却存在明显差异。总体而言，爱胜蚓作用效果优于环毛蚓，这可能和爱胜蚓及环毛蚓的形态、掘穴特征和取食习惯的差异有关，这些差异最终导致了两种蚯蚓对土壤氨基酸作用的不同^[23]，爱胜蚓表现更佳可能和其体型小，更加适应实验室小型培养容器有关。

土壤氨基酸含量的增加有利于土壤生态系统朝着稳定健康的方向发展。首先，它是植物重要的氮营养来源之一，可被植物直接吸收利用，氨基酸含量的大幅提高，可缩短植物吸收氮源的效率和时间，打破生态系统氮矿化速率的限制，促进根系对氮源的吸收，影响植物的生长发育，进而影响整个土壤生态系统的生产力；其次，氨基酸还是是土壤氮循环中重要的一环，氨基酸经过微生物氨化作用生成铵态氮，铵态氮在微生物经过硝化作用生成硝态氮，氨基酸的矿化作用、硝化作用和氨化作用相互影响相互调节共同影响土壤中氮的转化，其含量的增加可改变整个土壤生态系统中无机氮的含量；再次，土壤氨基酸可通过提供养分和活化养分两个途径提高土壤速效养分的含量；此外，土壤氨基酸含量的提高可以增加有机碳源的多样性，可促进土壤微生物多样性的恢复，改善微生物群落结构和功能，抑制植物病原菌的种群数量，提高植物的抗病害能力，减少连作障碍；同时，通过改变微生物数量、活性及为土壤酶创造良好的反应环境两个途径提升土壤酶的活性和数量，改善土壤理化性质，提升土壤质量。总之，土壤氨基酸的增加不仅促进了植物的生长发育，抑制了土传植物病原菌的定殖与存活，而且在土壤生态系统中化学元素矿化、土壤肥力保持与改善、能量转化和物质循环等方面发挥着了至关重要的积极作用^{[16, 17, 24, 25, 26]}。目前，普遍认为蚯蚓对土壤肥力条件的改善及随后植物生长的促进是主要原因，是蚯蚓通过生理代谢和生物扰动对土壤有机质、土壤酸度、土壤团聚结构和土壤生物活性等影响的总体表现，通过考察蚯蚓作用后氨基酸含量的变化及对土壤生态系统带来的影响，可以在一定程度上揭示蚯蚓影响土壤生态系统的作用机制。