葡萄(Vitis vinifera L.)为葡萄科葡萄属植物,目前是我国浙东沿海地区十分重要的经济栽培果树种类之一。我国浙东沿海地区葡萄设施栽培十分发达,但是,由于不适当的灌溉和使用化肥使土壤次生盐碱化日趋加重,有些葡萄栽植地土壤含盐量可以达到0.2%—0.8%,盐害成为限制葡萄生产的主要问题之一^{[1, 2]}。在盐胁迫的研究中,人们较多关注盐胁迫后叶肉细胞中的叶绿体、线粒体以及其它细胞器的变化。然而这方面的研究多集中在草本植物,如：水稻^{[3, 4]}、高粱^{[5, 6]}、大豆^{[7, 8]}等。在葡萄盐胁迫的研究中,研究较多为盐胁迫对葡萄各种营养器官细胞质膜透性、保护酶活性以及叶片光合作用特性的影响。如房玉林等^[9]发现盐胁迫抑制葡萄光合作用,樊秀彩等^[10]发现盐胁迫引起葡萄叶片膜透性增加,丙二醛(MDA)和游离脯氨酸含量显著升高,李会云等^[11]发现盐胁迫引起超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性先升高后降低,报道表明不同品种对盐胁迫的生理反应差异明显。但盐胁迫下葡萄叶片组织结构变化研究报道较少。‘鄞红’葡萄为浙东沿海地区主要栽培的品种之一,尤在浙江省宁波市沿海地带栽植为多,但其耐盐性尚不明确。本研究以‘鄞红’葡萄的生长变化,并结合其叶片细胞结构及光合特性等生理指标的变化,以探讨不同盐浓度处理下‘鄞红’葡萄的盐胁迫反应及耐盐性,为该品种在沿海地区的栽培管理提供理论指导。

以一年生‘鄞红’葡萄幼苗为试验材料。材料来自浙江万里学院葡萄大棚栽培试验地,试验时间为2014年5月—2014年8月。

试验设计5个NaCl盐胁迫浓度(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)。2014年5月15日,选取100株生长健壮、长势一致的1年生‘鄞红’葡萄幼苗,移栽到盆高24.5 cm、长53.5 cm、宽19.5 cm的塑料水培盆中,每盆5株,每个处理4盆,每盆装营养液 15 L。采用霍格兰改良培养液(Hoagland)培养45 d,具体方案如下：CK为1/15 Hoagland营养液；处理Ⅰ为1/15 Hoagland+0.2%NaCl；处理Ⅱ为1/15 Hoagland+0.4%NaCl；处理Ⅲ为1/15 Hoagland+0.6% NaCl；处理Ⅳ为1/15 Hoagland+0.8%NaCl。实验期间营养液用充气泵连续通气,每天补充水培盆中散失的水分至15 L刻度线,每5 d更换1次营养液。每隔15d进行采样,每个处理随机选取3株、每株任选功能叶片2张,用以测定葡萄的叶绿素含量、叶片气体交换参数及叶绿素荧光参数。

盐胁迫45d时,每个处理随机选取3株植株用于根系和叶片生长指标的观测；每个处理随机选取3株、每株任选功能叶片2张,用于叶片组织显微和栅栏组织细胞叶绿体超微结构的观测。

采用SPAD-502+PLUS叶绿素仪进行叶绿素含量的测定。采用GFS-3000便携式光合测定仪于10:00—14:00在有充足阳光下随机测定植株叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO₂浓度。

采用JUNIOR-PAM叶绿素荧光计进行叶绿素荧光参数的测定。待测叶片选择健壮功能叶,遮光处理30min后,测定PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、光化学电子传递效率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)。

采用万深LA-S全能型植物图像分析系统统计根系长、根直径、根表面积、根体积和叶片面积,重复3次,记录平均值。

从葡萄叶片中部主脉两侧取材(4mm×6mm)做石蜡切片,用FAA[福尔马林(38%甲醛溶液)5 mL,冰醋酸5 mL,50%乙醇90 mL]固定,乙醇和二甲苯系列脱水,石蜡包埋,横切片厚度10μm,番红-固绿染色。OLYMPUS光学显微镜下用测微尺测量叶表皮、栅栏组织和海绵组织厚度,并照相^[12]。各处理观测15个视野,取均值。

葡萄叶片中部主脉两侧取材(2mm×4mm),2.5%戊二醛前固定,0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.2)冲洗,1%锇酸固定,乙醇梯度脱水,丙酮置换浸透,Epon-812环氧树脂包埋,在70℃下聚合24h后,LEICA EM UC7型超薄切片机中获得70—90nm的切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色,HITACHI-7650型透射电镜观察,选取典型视野照相^[13]。各处理选取15个视野,观测葡萄叶片栅栏组织细胞叶绿体超微结构。

试验原始数据处理和绘图采用Excel 软件完成,差异显著性分析采用 SPSS 19.0软件。

如表 1 所示,处理Ⅰ根系和叶片的生长状况良好,各指标均与对照差异不显著(P>0.05);处理Ⅱ根系和叶片的生长状况一般,叶片出现少量黄斑,但仍能正常生长,各指标均与对照差异不显著(P＞0.05)。随着盐浓度加大,盐胁迫对‘鄞红’葡萄的伤害增强,处理Ⅲ叶片开始弯曲,并出现较多黄斑,各指标均显著低于对照(P<0.05)；处理Ⅳ叶片大量弯曲,并出现大量黄斑,生长受阻,各指标均显著低于对照(P<0.05)。

如图 1所示,‘鄞红’葡萄的叶绿素相对含量随着盐浓度的增强而减少,且随着处理时间的增长而下降增大。试验结束时,处理Ⅰ和处理Ⅱ与对照相比分别下降4.2%、7.2%,均与对照差异不显著(P>0.05)；而处理Ⅲ和处理Ⅳ与对照相比分别下降19.3%、27.5%,均显著低于对照(P<0.05)。

图 1 盐胁迫对‘鄞红’葡萄叶片中叶绿素相对含量的影响 Fig.1 Effects of NaCl stress on the chlorophyll relative content in ‘Yinhong’ grape leaves

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如图 2所示,盐胁迫对葡萄叶片气体交换参数有显著的影响。试验结束时,处理Ⅰ和处理Ⅱ叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO₂浓度(Ci)和气孔导度(Gs)与对照相比均差异不显著(P＞0.05)；但随盐浓度的进一步增强,各指标均显著下降,处理Ⅲ和处理Ⅳ叶片Pn、Tr、Ci、Gs与对照相比分别下降26.1%、21.1%、10.7%、30.0%和38.7%、29.9%、14.5%、50.0%,均显著低于对照(P＜0.05)。

图 2 盐胁迫对‘鄞红’葡萄叶片气体交换参数影响 Fig.2 Effects of NaCl stress on gas exchange parameters in ‘Yinhong’ grape leaves

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如图 3所示,盐胁迫下,葡萄叶片Fv/Fo、Fv/Fm、ETR、qP值均不同程度下降,而qN值升高。试验结束时,处理Ⅰ和处理Ⅱ各指标均与对照差异不显著(P＞0.05)；处理Ⅲ和处理Ⅳ叶片Fv/Fo、Fv/Fm、ETR、qP与对照相比分别下降56.3%、19.8%、27.0%、34.6%和 63.3%、24.7%、44.4%、45.2%,均显著低于对照(P＜0.05),而qN分别升高65.7%和122.9%,均显著高于对照(P＜0.05)。可能高盐胁迫降低了葡萄叶片PSⅡ 反应中心的潜在活性、光能转化效率和电子传递,增加了通过非光化学途径的能量耗散^[14]。

图 3 盐胁迫对‘鄞红’葡萄叶绿素荧光参数的影响 Fig.3 Effects of NaCl stress on chlorophyll fluorescence parameters in ‘Yinhong’ grape

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正常无盐胁迫时,栅栏组织细胞为长柱状,排列较整齐,海绵组织细胞排列较紧凑,细胞内富含叶绿体(图 4A)。处理Ⅰ和处理Ⅱ叶片组织显微结构与对照差异不显著(图 4B、C)。随着盐浓度持续增大,栅栏组织细胞开始积累大量沉积物,形状变得不规则,海绵组织和栅栏组织细胞数目都减少,细胞间隙变大,叶绿体在细胞内不规则分布且变少(图 4D、E)。对不同盐浓度处理45d后的叶片解剖结构定量测定发现：处理Ⅰ和处理Ⅱ叶片表皮层、栅栏组织、海绵组织厚度以及栅栏组织/海绵组织比与对照无显著差异(P>0.05),处理Ⅲ和处理Ⅳ葡萄叶片表皮层、栅栏组织、海绵组织厚度显著增大(P<0.05),栅栏组织/海绵组织比显著减小(P<0.05)(表 2)。

图 4 盐胁迫下‘鄞红’葡萄叶片横切面图 Fig.4 The cross-section of ‘Yinhong’ grape leaves under salt stress A、B、C、D、E 分别为正常处理、0.2%NaCl胁迫、0.4%NaCl胁迫、0.6%NaCl胁迫、0.8%NaCl胁迫下‘鄞红’葡萄叶片横切面(标尺=20μm); EP：表皮细胞；PT：栅栏组织；ST：海绵组织 A,B,C,D,E show the cross-section of ‘Yinhong’ grape leaves under normal conditions,0.2%NaCl stress,0.4%NaCl stress,0.6%NaCl stress,0.8%NaCl stress (Bar=20μm); EP:Epidermal cell; PT: Palisade tissue; ST: Spongy tissue

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正常情况下,葡萄栅栏组织细胞液泡膜完整,叶绿体呈扁平状,被液泡挤在细胞边缘,叶绿体基质片层和基粒片层与叶绿体长轴近似平行排列,基粒片层多,类囊体排列紧密而整齐,基质浓厚,内含淀粉粒与嗜锇颗粒相对小且少(图 5A)。处理Ⅰ与对照差异不显著(图 5B)；处理Ⅱ开始出现胁迫现象：叶绿体肿胀,内含淀粉粒和嗜锇颗粒增多且变大(图 5C),但与对照差异不显著；随着盐浓度持续增大(处理Ⅲ和处理Ⅳ),胁迫显著：叶绿体明显肿胀变大,片层结构松散,基质稀薄,内含淀粉粒和嗜锇颗粒显著增多且变大(图 5D、E)。

图 5 盐胁迫对‘鄞红’葡萄叶片栅栏组织叶绿体超微结构的影响(×20000) Fig.5 Effects of salt stress on ultrastructure in palisade tissue chloroplast of ‘Yinhong’ grape leaves(×20000) A、B、C、D、E 分别为正常处理、0.2%NaCl胁迫、0.4%NaCl胁迫、0.6%NaCl胁迫、0.8%NaCl胁迫下‘鄞红’葡萄叶片栅栏组织细胞叶绿体超微结构(标尺= 0.5μm); Chl：叶绿体；V：液泡；S：淀粉体； P：嗜锇颗粒 A、B、C、D、E show cell ultrastructure in palisade tissue of ‘Yinhong’ grape leaf under normal conditions,0.2%NaCl stress,0.4% NaCl stress,0.6% NaCl stress,0.8%NaCl stress (Bar=0.5μm); Chl: chloroplast; V: vacuole; S: starch grain; P: plastoglobules

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盐胁迫首先影响葡萄根系的生长,如葡萄生根率和生根数量^[15]。葡萄的耐盐能力种类和品种之间存在一定的差异^{[16, 17]},本研究结果发现,‘鄞红’葡萄在0.2%—0.4%盐浓度范围内,其根系生长基本正常,由此表明该品种具有一定的耐盐性。

叶片是植物光合作用的器官,而叶绿体作为植物进行光合作用的场所,其结构的有序性和完整性决定了其光合生产能力的大小,完整的叶绿体结构是保证植物进行正常光合的前提,如果受到盐胁迫的伤害,就会导致叶绿体膜系统的紊乱和破坏,所以叶绿体是植物细胞中对盐分最敏感的细胞器^[14]。秦玲等^[18]发现高盐胁迫下叶片组织显微、叶绿体超微结构发生了显著变化。在本研究中,低盐胁迫下(NaCl≤0.4%),叶片组织显微、栅栏组织中叶绿体超微结构基本正常,表明‘鄞红’葡萄具有一定的耐盐性；而高盐胁迫下(NaCl＞0.4%),叶片组织显微、叶绿体超微结构发生显著变化,且随着盐浓度增加,胁迫越显著,可能是由于受到盐胁迫后,细胞的渗透压发生改变导致叶绿体膜系统的紊乱和破坏进而造成叶绿体分解。另外,淀粉粒的变化可能是由于叶绿体结构受到破坏,光合作用合成的糖类无法输出或输出量降低而迅速转化成淀粉,导致淀粉在叶绿体中大量累积形成淀粉粒；而嗜锇颗粒的变化可能是由于叶绿体类囊体膜降解导致脂质类物质在叶绿体或液泡中大量聚集。

植物叶片叶绿素含量是衡量植物抗逆性的重要生理指标之一^[19]。大部分植物在盐胁迫下叶绿素含量降低^{[20, 21, 22]},一方面可能是叶绿体色素合成酶活性降低,叶绿素合成受阻而造成；另一方面也可能是盐胁迫引起了叶绿体功能的紊乱,或加速了叶绿素的分解和叶绿体形态结构的受损使植物叶片内含量减少^[22]。本研究发现,低盐胁迫下(NaCl≤0.4%),叶绿素含量无显著变化,表明‘鄞红’葡萄具有一定的耐盐性；而高盐胁迫下(NaCl＞0.4%)叶绿素含量显著下降,可能是由于叶绿体结构受损引起。

净光合速率是植株光合系统正常与否的指标^[23],而气孔对环境变化的协同响应是植物在盐胁迫条件下叶片净光合速率变化的主导因子^{[22, 24]}。本研究发现,叶片净光合速率和气孔导度之间均存在高度的线性相关,而且随着盐浓度的增大,Gs、Pn及Tr皆显著降低,表明盐胁迫下气孔限制是导致葡萄净光合速率降低的主要原因之一,这与前人研究高粱的结果一致^[5]。另外,在胁迫后期(胁迫后30d和45d时)Ci有所升高,表明在胁迫后期,非气孔限制占了主导因素,这可能是随着胁迫加重,叶肉细胞受到损伤,叶绿体结构破坏等原因造成的。

叶绿素荧光与光合作用效率密切相关,任何环境因素对光合作用的影响都可通过叶绿素荧光反映出来^[25]。Fv/Fo代表 PSⅡ 的潜在活性；Fv/Fm代表PSⅡ的最大光化学效率,反映了当所有的光系统域(PSⅡ)反应中心均处于开放态时的量子产量,可直接作为原初光化学效率的指标^[26]；ETR代表光化学电子传递效率；qP代表光化学猝灭系数,反映PSⅡ天线色素捕获光能用于光化学电子传递的份额^[27]；qN代表非光学猝灭系数,反映PSⅡ天线色素吸收的光能以热能的形式耗散掉的部分^[21]。本研究发现,随着盐浓度的增加,Fv/Fo、Fv/Fm、ETR和qP值降低,表明高盐胁迫(NaCl＞0.4%)使PSⅡ 潜在活性中心受损,光化学电子传递效率和光能利用率降低,光反应受到抑制；而qN值显著升高,表明PSⅡ 天线色素吸收的光能以热能形式耗散掉的部分增加,而以用于光化学电子传递的份额减少,这与qP下降相吻合。由此表明,盐胁迫对葡萄幼苗的叶绿素荧光参数存在较大影响,这与其解剖结构、叶绿素含量、净光合速率的变化结果相吻合,进一步证实‘鄞红’葡萄有一定的耐盐性。

综合以上研究结果发现,低浓度盐分(NaCl≤0.4%)处理下‘鄞红’葡萄生长基本正常,其叶片叶绿素含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数、细胞组织显微和栅栏组织叶绿体超微结构均与对照差异不显著,高浓度盐分(NaCl＞0.4%)抑制其生长,叶绿素含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数、叶片细胞组织显微和栅栏组织叶绿体超微结构均发生了显著变化,表明‘鄞红’葡萄具有一定的耐盐性。