由于重金属污染事件的频繁发生,食品安全和无公害蔬菜的生产已经成为人们关注的热点。蔬菜重金属污染与土壤重金属污染有密切的关系。最新调查发现,镉(Cd)是中国土壤污染最严重的重金属,存在很高的潜在风险^{[1, 2, 3]},全国污染面积已经达到1.4x10⁴ hm^2[4]。Cd是毒性最强的生物非必需的重金属元素之一^[5],具有较强的水溶性,极易被蔬菜吸收进入食物链^[6],特别是叶类蔬菜^{[7, 8]}。进入人体后的Cd不易被排出体外,长期积累会导致慢性中毒,对人类的健康有直接的影响^[9]。世界卫生组织规定每日最大允许摄入Cd的量均为1 μg/kg^[10];据估计,人体中70%的Cd来自于蔬菜^[11]。可见对蔬菜重金属Cd含量的检测是十分必要的。

正常生长的绿色植物具有典型的反射光谱曲线。当重金属Cd胁迫时,Cd²⁺可上行进入植物体叶片中,首先在细胞壁积累,并通过离子泵进入细胞,代替其它二价离子参与到细胞代谢过程,从而影响细胞色素的形成,改变细胞的渗透压,使生理代谢紊乱,最终造成细胞内部结构发生变化^{[12, 13]}。植物叶片细胞内色素含量的变化将影响到叶片对光的吸收与反射^[14];细胞结构的变化将会改变光在植物体内反射和散射的路径,使叶片光反射率发生变化^[15]。这说明Cd污染会间接地影响植物叶片的光反射率,所以可以推断植物叶片Cd积累量与叶片光谱反射率之间存在一定的相关关系。此外,高光谱遥感技术在精准农业中的快速发展,也为准确、无损、动态地诊断和检测农作物重金属含量提供了可行性的方法。

近几年来高光谱技术已经被广泛应用于重金属污染检测。关丽^[15]等对镉胁迫下水稻的生理生态表征研究,建立了光谱指数的二维模型,揭示了在不同浓度的镉处理下叶绿素、水分和细胞结构等响应因子在各光谱指数空间的分布规律;Daubechies小波系中的“Db5”小波函数第 5 层小波系数能精准探测锌污染水稻光谱的奇异性,并发现光谱奇异与叶片锌含量有较强的相关性(R²=0.8445)^[16];基于光谱参数的多级指数空间的方法可以有效的诊断水稻镉污染程度^[17]。又有研究者进一步将芦苇叶片叶绿素含量作为中间指标估算重金属Pb、Cu和Zn的浓度,其结果认为基于实验室的高光谱数据具有预测芦苇中重金属Pb、Cu和Zn的能力^[18]。以上研究利用光谱位置、光谱指数和不同的方法等初步探索了高光谱技术对植物受重金属污染程度的检测,但对于能够有效地、精确地预测植物本身所含的重金属含量的检测并没有更深入的研究。

小白菜(Brassica rapa chinesis)属于十字花科芸薹属植物,是一种较为常见的叶类蔬菜,并具有生长速度快、分布广、环境适应能力强等特点。有研究发现十字花科芸薹属中有多种植物具有超富集植物的特性^[19],如天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)^[20]、印度芥菜(Brassica juncea)^{[21, 22]}对重金属Cd有较强的富集能力。本试验以小白菜为研究对象,获取镉污染下小白菜叶片的高光谱反射率和镉含量,对两者进行相关分析,基于光谱特征参数建立反演小白菜叶片镉含量的模型,预测小白菜叶片所含的镉含量,进一步判断小白菜受污染的程度,以期为蔬菜食用安全提供科学鉴定技术和无公害蔬菜生产提供理论依据。

试验所用小白菜(快菜30)由重庆市洪圣蔬菜种子有限公司制种。

实验土壤取自西南大学生态园。将试验土壤自然风干,过2 mm筛。将处理好的实验用土分别加入不同量的重金属镉(以Cd²⁺含量计),混匀,试验设6个处理0 mg/kg (CK)、0.5 mg/kg (T1)、1 mg/kg (T2)、5 mg/kg (T3)、10 mg/kg (T4)、20 mg/kg (T5),每个处理设置8个重复。将混合好的镉污染土壤装盆,每盆2 kg,浇水,稳定30 d。

选取饱满、均匀一致的小白菜种子,用1%次氯酸钠溶液浸泡15 min,然后用去离子水反复冲洗,再用滤纸将水吸干后将其置于铺有纱布的托盘中,放于培养箱中24 h。于2013年10月08日将小白菜种子播种在上述处理的土壤中,每盆栽种10粒。在种子萌发生长10 d后,进行定植,每盆留2株健壮幼苗。将所有盆钵(带底盘)放置于西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室实验基地大棚(透明顶棚,四周开敞)培养。自小白菜萌发到采样结束所用时间为30 d。期间最高平均气温在20 ℃左右,平均降雨量约为75 mm。在培养期间进行常规田间管理。

光谱数据测量采用美国ASD FieldSpec Pro便携式野外光谱仪,波段范围为350—2500 nm,350—1100 nm采样间隔为1.4 nm,1000—2500 nm采样间隔为2 nm。350—1100 nm光谱分辨率为3 nm,1000—1900 nm光谱分辨率为8.5 nm,1700—2500 nm光谱分辨率为6.5 nm。光谱测定选择晴朗无云无风的天气,测量时间为北京时间10:00—14:00之间。光谱共采集2次,分别在萌发后的第15天和30天进行光谱反射率测定,其中第15天时,每个处理随机采集5个重复样本;第30天时,每个处理采集3个重复样本。每个重复样本选择3片叶片,每片叶片采集10次光谱数据,以其平均值作为该叶片的光谱数据。各样本测定前都进行白板定标(标准白板反射率为1)。

光谱采集完成后,将相应叶片取样带回实验室,采用火焰原子吸收光谱法测定镉含量(mg/kg)。

微分光谱是光谱分析中常用的基线校正、背景消除和光谱分辨率预处理方法,它既可以消除基线漂移或平缓背景干扰的影响,也可以提供比原光谱更高分辨率和更清晰的光谱轮廓变换。一阶微分曲线体现了原始反射光谱的变化趋势。本研究中采用直接差分法计算小白菜光谱反射率的一阶微分光谱。光谱的一阶导数可以用以下公式计算：

ρ′(λ_i) = [ρ(λ_i +1) - ρ(λ_i - 1)]/ 2Δλ

式中,λ_i为每个波段的波长,ρ(λ_i)、ρ′(λ_i)分别为波长λ_i的反射率和一阶微分光谱,Δλ为波长λ_i - 1到λ_i的间隔。

利用ViewSpec Pro处理软件将测得的叶片反射光谱数据进行初步处理,并通过Excel 2003、SPSS 20.0和Origin 8.5对数据进行统计分析和绘图。

影响植物光谱变化的主要因素是植物体内的色素、水分和细胞结构。在镉胁迫条件下,植物的这些胁迫敏感因素会发生变化,而这些细微的变化可通过光谱反射率的变化表现出来^[20]。本研究通过不同浓度镉处理发现,在可见光区域(图 1:350—700 nm),540 nm附近小白菜叶片反射率随着镉处理浓度的增加呈下降的趋势;蓝紫光和红橙光两个强吸收谷的反射率有上升的趋势,但变化程度不是很明显。近红外(720—1300 nm)范围内,小白菜叶片光谱反射率随着镉处理浓度的增加呈逐渐下降的趋势(图 1: 350—2500 nm)。在1300 nm之后,小白菜叶片反射率的变化情况与近红外区域的变化相似。T1组的小白菜叶片反射率在整个光谱中的变化趋势与对照组没有较大差异,说明低浓度Cd处理对小白菜叶片影响不明显。

图 1 镉胁迫下小白菜叶片的光谱曲线(15 d) Fig.1 Spectrum curve of leaves in B. rapa chinesis under the cadmium stress(15 d)

图选项

镉污染对植物的生理生化影响过程是很复杂的,具有隐蔽性和滞后性。为确定小白菜镉污染光谱的特征波段,将实验所得两个生长期的叶片镉含量数据与原光谱、一阶微分光谱进行总体相关分析。结果发现：在可见光区,叶片镉含量与原光谱的的相关性较弱,相关系数值小于0.45;在红边和近红外区域相关性较好,与镉含量呈负相关,相关系数值为0.6左右,并通过P=0.01的水平检验;1900 nm之后的区域相关性最差(图 2)。叶片镉含量与光谱一阶微分导数相关系数值大于0.6(P=0.01)的波段范围有：559—601 nm、826 nm、887 nm、898 nm、899 nm、964—968 nm、1689 nm、1690 nm、2272 nm和2288—2290 nm,在色素、细胞结构和水含量影响因素控制的光谱范围内都有分布(图 2)。这说明镉污染对小白菜叶片光谱的影响需要通过综合多个特征波段的信息来体现。

图 2 小白菜镉含量与原光谱、光谱一阶微分的相关性分析 Fig.2 The relation analysis between cadmium content and the original spectra and the first derivative spectra of B. rapa chinesis

图选项

在高光谱遥感技术领域中,光谱参数作为特征参数广泛应用于植被光谱变化的研究。光谱参数可以综合多个敏感波段的特征,加强对信息的提取能力,避免单一波段的偶然性和不精确性。为了提取镉污染下小白菜叶片光谱的特征性信息,根据小白菜镉含量和叶片光谱数据的相关分析结果以及前人的相关研究,本研究选择了能反映叶绿素、水含量和细胞结构潜在变化的光谱参数(表 1)。

利用镉处理15 d的小白菜光谱数据计算得到表 1中的光谱参数,然后与对应的小白菜镉含量数据进行相关性分析,结果由图 3所示。其中,反映叶绿素含量变化的4个参数与镉含量响应能力从高到低为：SDy、 MCARI、SDb(蓝边面积Blue Edge Area)、RVSI(红边植被胁迫指数)。4个参数中SDy与镉含量相关性最好,表明镉污染对小白菜叶片光谱黄边(550—580 nm)区域的影响较明显。MCADI是综合反映叶绿素变化的指标,MCADI对镉含量较为敏感是因为镉污染影响了小白菜叶片中的叶绿素的合成,导致MCADI与镉含量间接呈现出较好的相关性。由此可将SDy和MCADI作为反映叶片镉含量的敏感参数。

图 3 小白菜生理敏感参数与镉含量的相关系数(n=30) Fig.3 The correlation coefficient between psychology sensitive parameters and Cd contents of B. rapa chinesis(n=30) MCARI: 叶绿素吸收反射修正指数Modified Chlorophyll Absorption Reflectance Index; RVSI: 红边植被胁迫指数Red Edge Vegetation stress Index;SDb: 蓝边面积Blue Edge Area;SDy: 黄边面积Yellow Edge Area;WI: 水质指数Water Index;DSWI: 病态水分胁迫指数Disease Water Stress Index;LWVI: 叶片水含量植被指数Leaf Water Vegetation Index;VLWVI: 动态叶片水含量植被指数Variation Leaf Water Vegetation Index;PRI: 光化学反射指数Photochemical Reflectance Index;RVI: 比值植被指数Ratio Vegetation Index;NDVI: 归一化植被指数Normalized Difference Vegetation Index;Dr : 红边幅值The Amplitude of the Red Edge;SDr: 红边面积Red Edge Area

图选项

镉胁迫会使植物对水分的吸收减少,进而影响其生理生化的过程^[17]。图 3中反映水含量变化的参数WI、DSWI、LWVI(叶片水含量植被指数)和VLWVI(动态叶片水含量植被指数Variation Leaf Water Vegetation Index)与镉含量均表现出较好的相关性,其相关系数分别为-0.864、-0.829、0.78和-0.697(P<0.01)。叶片细胞水质指数WI和病态水分胁迫指数DSWI是综合体现植物细胞的健康的光谱指数,它们与镉含量的相关系数值都大于0.8,因此选择WI、 DSWI这2个参数作为反演小白菜叶片镉含量的敏感参数。

当镉胁迫程度达到一定阈值时,细胞膜与细胞器内膜系统都会被破坏,细胞通透性改变,进而使细胞物质和能量转运受阻,生理代谢紊乱^{[23, 24]}。严重胁迫将最终导致细胞死亡。反映细胞结构情况的参数与叶片镉含量的相关分析发现(图 3),基于红边位置的参数Dr、SDr表现出较好的相关性,其相关值分别为0.833、0.886(P<0.01)。这说明对叶片光谱反射的影响主要反映在光谱的红边位置区域。因此光谱参数Dr、SDr也可作为反演小白菜叶片镉含量的敏感参数。

将镉胁迫15 d时的镉含量数据与MCADI、SDy、WI、DSWI、Dr和SDr 6个参数进行了回归建模分析,建立了各参数的一元线性、对数、倒数、指数和抛物线的镉含量反演模型。其中每个参数的倒数模型的精度比其它类型的模型的精度更优,因此选择各参数的倒数模型作为镉含量反演的模型(表 2)。6个倒数模型的R²值均大于0.6(P<0.01),其中SDr对应倒数模型的R²值为0.811,具备较好的镉含量反演潜力;MCADI的倒数模型的R²值最小,反演小白菜叶片镉含量的能力相对较弱,这说明镉污染下小白菜细胞结构和水分含量的参数模型比叶绿素含量的参数模型有更好的反演能力。

为了检验6个参数所建立模型的敏感性和可靠性,选用镉处理30 d的小白菜叶片光谱数据计算得到6个光谱参数,分别将它们作为自变量预测30 d小白菜叶片的镉含量,然后与实际测得叶片镉含量进行线性拟合,拟合结果如图 4所示。SDr对应的倒数模型的反演结果最优,R值达到0.873,表明该模型预测的镉含量数值最接近真实值。SDy参数的倒数模型反演能力较优,R值为0.811,该模型也可用于粗略的估算小白菜叶片的镉含量。MCARI、WI、DSWI和 Dr的模型反演效果均不理想。在图 3中,15 d时WI、DSWI与镉含量有较好的相关性,但在反演30 d叶片镉含量时效果很差。

图 4 预测镉含量与实测镉含量的拟合曲线(n=18) Fig.4 The fitting curve between prediction of cadmium content and measured cadmium content

图选项

一般而言,镉污染对蔬菜的生长、发育均有危害,重金属镉在蔬菜内积累含量超过0.2 mg/kg(鲜重),蔬菜的食用将存在安全隐患^[25]。本试验对镉污染胁迫下小白菜叶片的高光谱检测中发现,在可见光、近红外和远红外区域内,镉污染对叶片的光谱反射率的影响是较明显的。与金铭^[26]的研究结果相同,随着镉胁迫程度的增加,两个叶绿素强吸收带的深度变浅,540 nm附近的反射率变小。在近红外波段的叶片光谱对镉胁迫的响应是因为Cd²⁺进入植物体后首先在细胞壁积累,然后与细胞膜蛋白的亲离子基结合,引起细胞膜结构和功能发生改变。细胞结构的改变使正常的光传输路径发生变化,最终以叶片光反射的形式表现出来,主要反映在光谱的红边位置区域。1300 nm之后的波段与红外波段小白菜叶片反射率变化趋势相同,原因可能是该波段的叶片光谱反射率主要由叶片含水量控制,而叶片水含量的变化是由细胞结构、营养成分等综合因素控制,所以会与近红外波段的表征相似。

不同温度环境下番茄冠层反射率变化主要在480—670 nm和720—810 nm两个区域^[27],与之相似,本研究中小白菜镉含量与叶片原光谱、一阶微分光谱的黄边、红边,近红外和远红外区域相关性较好。其敏感波段在对应的色素、水分和细胞结构控制的波段范围内均有分布,说明镉污染对小白菜的影响是一个复杂的生理过程,不能仅通过单一波段或是单一区域来体现,需要综合因子来判断。如苹果树叶片全氮含量的研究中,两波段组合后得到的光谱变量(尤其在对数处理后)与全氮拟和方程的拟合精度比单一波段方程的拟合度要更优^[28];水稻在氮-水交替胁迫下,相对于原始光谱筛选的波段组合,转换后的波段组合的拟合较高和验证结果均更好^[29]。而镉在植物叶片内的积累对其生理的影响可通过不同的生理指标体现出来,如叶绿素、营养元素、含水量、细胞结构等^[30],这些指标的微小变化可能会使叶片的光谱特征发生变化,所以本文结合前人的研究成果以及本研究的相关性分析结果选择控制叶片光谱变化的叶绿素、水分和细胞结构相关的光谱参数作为诊断小白菜污染的指标。

基于光谱参数对植被叶绿素含量、水分、营养元素等的估算方面已经取得较好的成果,光谱参数的广泛应用表明它们可从多个波段综合植物的光谱信息。当小白菜镉胁迫15 d时,参数SDy、MCARI、Dr和SDr与镉含量的相关性分别为0.815、-0.773、-0.833和-0.886,表明镉污染对小白菜叶片光谱黄边位置、叶绿素响应波段以及红边位置有明显的影响。这与靳彦华^[31]等对水分胁迫下春小麦叶片光谱研究结果相似,各地春小麦叶绿素含量与绿边和黄边曲线变化速率有很好的相关性。关丽等^[17]在镉污染下水稻冠层信息诊断的研究中发现,水稻细胞结构变化与红边范围内波段较敏感。但与李丙智等^[28]的研究结果相反,该研究得出在正常生长条件下,苹果树叶片全氮含量与黄边位置及红边位置和黄边面积所构建的比值植被指数和归一化植被指数的相关性较弱。这可以反向证明胁迫环境能够使植物叶片的光谱反射率在黄边、红边位置发生变化^[32]。体现含水量变化的4个光谱参数与镉含量的相关系数值均较好,这主要是镉胁迫下小白菜叶片的含水量产生了变化,与之相对应的光谱区域做出了敏感响应。

以光谱参数为自变量,镉含量为因变量的一元回归建立模型,发现特征参数的倒数模型反演镉含量的敏感性最好。用15 d数据建立的模型估算30 d小白菜叶片镉含量的预测值和实测值的拟合证明SDr的对应的倒数模型的预测效果最优,SDy的居于第二。而WI和DSWI的预测能力最差,这可能是在这两个时期,镉污染对叶片水含量影响较大或是水含量的变化不稳定,也可能是其它因素制约水含量的变化,导致由水分控制的光谱波段产生了较明显的差异,从而导致估算结果不理想。由以上结果说明,SDr参数建立的倒数模型可以较好地预测小白菜叶片的镉含量,也可以很好地预测小白菜生长后期的叶片镉含量,进而也验证了镉胁迫下基于红边位置参数有丰富的光谱信息。

综上所述,对15 d时小白菜叶片光谱及镉含量数据进行分析筛选,得出SDr、Dr和WI这3个光谱参数所建立的倒数模型有较好的精度,具有较好预测镉污染下叶片镉含量的能力。但是用WI建立的倒数模型预测处理30 d时小白菜叶片镉含量的能力较差,不能达到提前预测小白菜生长后期的叶片的镉含量。其中SDr和Dr能够用于早期预测镉污染30 d时小白菜的叶片镉含量,但预测精度还需提升。本研究结果虽然可以用于预测小白菜的镉污染程度,但是对于污染时间有一定局限,污染时间越长预测的精度就会越低。这一问题可以通过增加样本数量提高模型精度来解决。