目前我国华东地区大气背景中O₃浓度已达50 nL/L，已经超过了敏感作物O₃伤害阀值AOT₄₀的25%^[1]，而且每年还以0.5%—2%的速度递增^[2]。空气中SO₂、NOx、黑碳、飞灰、土壤尘粒子等，引起大气气溶胶光学厚度逐年增加，导致地面变暗变冷^[3]。仅亚洲大气棕色云的直接辐射强迫引起的年均地表变暗就达14—16 W/m²(大约6%)^[4]。近地层臭氧浓度增加和大气气溶胶引起的太阳辐射减弱等因素构成了复杂的大气背景。近地层大气太阳辐射减弱和O₃浓度增加是全球科学家和公众密切关注的重要环境问题。地表O₃和太阳辐射变化对土壤微生物的影响研究较少，Aneja M K等认为O₃浓度增加降低了土壤微生物的群落结构^[5]。陈展等认为臭氧浓度升高降低了盆栽小麦根系的生长和土壤微生物功能^[6]。Voidarou 等认为O₃浓度增加降低了环境中指示细菌的生长^[7]。Johnson RM和李果梅分别报道了O₃浓度升高对麦田土壤酶活性及酚酸类物质含量产生影响^{[8, 9]}。太阳辐射减弱通过改变光合有效辐射(PAR)，使作物光合作用受抑制，作物减产，改变了碳、氮在植物中的分配^{[10, 11, 12, 13, 14]}，改变了土壤中凋落物以及植物根系分泌物的数量和成分，改变了土壤温、湿度和pH值^{[15, 16, 17]}，对土壤生态系统产生的影响有大量报道，而对土壤微生物的影响研究很少，特别是地表O₃浓度增加和太阳辐射减弱复杂大气背景下，土壤微生物多样性的响应趋势国内外鲜见报道。土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构功能及过程，是维持土壤生产力的重要组分^[18]，土壤微生物种群的改变是土壤有机质变化的早期指标^[19]，可以敏感地指示气候和土壤环境条件的变化^[20]。土壤微生物多样性在研究方法、研究范围等方面得到了广泛的重视，大量的研究认为，植被、土壤的管理方式包括农药的应用、施肥、耕作方式等，通过影响土壤有机碳和氮的水平、土壤含水量、温度、通气性及pH值等来影响土壤微生物多样性^{[21, 22, 23, 24]}。土壤生态系统通过植物倍受大气环境的影响，Lou Y S报道紫外线增强降低了土壤微生物量碳氮的含量^[25]。展小云等认为，加倍CO₂浓度显著提高土壤微生物的活性及功能多样性^[26]；Gallo M，张乃莉等，认为气候变暖和大气N沉降改变了土壤微生物多样性^{[6, 27]}。然而孤立地分析单一环境因子对地下生化过程的影响，无法准确全面地评估土壤微生物群落对未来全球变化响应的真实情况。因为自然生态系统中，各种全球变化现象间的交互作用无处不在。为了研究地表O₃浓度增加和太阳辐射减弱对土壤微生物多样性的交互影响，本文定点进行了两年试验，研究土壤微生物碳代谢指纹的变化，计算微生物多样性，为研究复杂大气背景对土壤微生态系统的影响提供参考。

于2008年至2011年在南京信息工程大学农业气象试验站(32.16°N，118.86°E)进行冬小麦生长季田间观测试验。当地多年平均温度为15.6 ℃，多年平均降水为每年1 100 mm。供试土壤为潴育型水稻土(灰马肝土属)，土壤质地为壤质黏土，耕层土壤黏粒含量为26.10％，土壤pH(H₂O) 值为6.20，有机碳和全氮的含量分别为19.40 g/kg、1.15 g/kg。

试验采用直径3 m，高2.5 m 的开顶箱(OTC)作为臭氧布气的容纳装置，O₃发生器(江苏省南京市万杰臭氧机电设备厂，WJ-H-Y5 型)通过电解空气中的O₂产生O₃；风机把空气和由发生器产生的O₃ 混合后，由布气系统均匀地吹送到作物冠层；采用O₃检测仪(新西兰aeroQUAL公司，S200型)对气室内O₃浓度进行监测，通过阀门对室内浓度进行调节和控制。O₃浓度设置为100 nL/L (T)，为农田本底浓度的2 倍。OTC内设置臭氧浓度传感器(精度：1 nL/L),对臭氧浓度传感器进行预先设定浓度阈值，当OTC内臭氧浓度未达到此阈值时，臭氧发生器持续工作并向OTC内通入臭氧气体，当OTC内浓度超过此阈值时，臭氧传感器则提示报警，其信号通过微型电子控制仪的指令控制与臭氧发生器相连的电磁阀断开，此时臭氧发生器停止工作。这样可实现OTC内臭氧浓度的自动调控，每天臭氧处理时间段为08:00—16:00，遇有雨天则关闭整个装置。

遮荫棚采用镀锌钢管为主要支柱，搭建成3 m×3 m×3 m的立方体，两两间隔3 m。遮荫棚顶部用铁丝搭建为可上下调节的网状结构，用以支撑遮荫网，采用TBQ-2型总辐射表对不同处理下达到冬小麦冠层的太阳总辐射强度进行了监测，监测时间为6:00—18:00，步长为1 min，每日实际监测到的太阳总辐射强度瞬时值(W m^-2 min^-1)(图 1)。通过计算确定各处理组实际接收的太阳辐射强度分别比对照减弱(20±5)%、(40±5)%、(60±5)%，田间大气O₃浓度和太阳辐射强度没有人为干扰。并随着作物生长高度，调节遮荫网与冬小麦冠层间的距离，根据情况适当更换遮荫网，保证网下空气流通，使到达植物冠层的太阳总辐射变化量控制在预设值±5%范围内。在通入100 nL/L臭氧的OTC棚上方分别搭建不同透光度(网孔密度不同)的黑色聚乙烯遮荫网，使棚内处于100 nL/L O₃熏气与太阳辐射分别减弱20%、40%、60%的复合环境中。试验设置T+S1(O₃浓度为100 nl/L+太阳辐射强度减弱20%)、T+S2(O₃浓度为100 nL/L+太阳辐射强度减弱40%)、T+S3(O₃浓度为100 nl/L+太阳辐射强度减弱60%)三组双因子处理，另设T(O₃浓度为100 nl/L)和S1(太阳辐射减弱20%)的单独作用，共5个处理，12个OTC棚和12个遮荫棚，实现每处理3次重复。以不通入O₃不加遮荫网的OTC棚为对照。同步测定O₃浓度和辐射通量，使O₃误差控制在8%，使辐射误差控制在5%以内。

图 1 不同处理下冬小麦冠层太阳辐射强度 Fig.1 Solar irradiance of winter wheat canopy under different treatments T: O3浓度设置为100 nL/L;S1: 太阳辐射强度减弱20%;S2: 太阳辐射强度减弱40%;S3: 太阳辐射强度减弱60%

图选项

供试小麦品种为扬麦13号，水肥供应适量而充分,其他农田管理措施均相同,无病虫害及杂草的影响。播种日期、熏气起止日期、采样日期以及AOT40累积量如表 1所示。按五点取样法，定点分别选取5株小麦，将其0—20 cm耕层根系区土样挖出，抖掉根系外围土，取紧贴在根表附近的土样，混合后作为根际土，用四分法取适量装于无菌纸袋中，立即带回实验室，4 ℃下冰箱保存，用于土壤微生物碳代谢指纹的测定。

土壤微生物碳源利用多样性应用BIOLOG生态测试板(ECO MicroPlate,美国Matrix Technologies Corporation生产)测定，Biolog EcoPlatesTM 技术是一种酶联免疫吸附剂测定方法(ELISA,enzyme linked immunosorbent assay)^[28]。每块Biolog EcoPlate微孔板上有96 个孔,3 份重复，每份重复有32 孔(包括1个对照孔和31个单一碳源孔)，除对照孔仅有水和指示剂以外，其余31 孔都装有单一碳源和四唑染料。微生物利用单一碳源的代谢过程中产生氧化还原反应，使四唑染料变成紫色，根据每孔颜色变化程度检测微生物的代谢能力。称取抽穗期各处理新鲜土10 g，加入90 mL 0.85% NaCl无菌溶液于三角瓶中，无菌棉花塞封口后在摇床上震荡(200 r/min)30 min，按10 倍稀释法用0.85% NaCl无菌溶液将其稀释至原来的1 /1000，稀释液经离心去除残留的土壤后，上清液用于接种。接种悬浮液于生态测试板微孔板中，每孔150 μL，每样3 次重复，将接种好的测试板加盖在(25±1)℃下暗箱培养；连续培养10 d，期间每隔24 h用ELISA反应微平板读数器在590 nm处读取吸光度^{[29, 30]}。

采用孔平均颜色变化率法(AverageWelL-Color Development,AWCD)测定土壤微生物利用单一碳源的能力^[28]。AWCD的计算公式为:

当能观测到大部分微孔中微生物群落的反应，而且大部分活跃的微生物群落已达到颜色变化的渐近线时的培养时间为96 h，因此选择培养96 h时的数据，采用DPS软件，根据土壤微生物群落对31 种单一碳源利用的相似性，应用表 2中的方法计算多样性指数，进行新复极差检验和主成分分析。

表 2 土壤微生物群落功能多样性指数的计算公式 Table 2 The equations of function diversity indexes of soil microbe community

多样性指数 Diversity indexes	用途 Purposes	公式 Equations	备注 Remarks
香农指数 Shannon index	评估群落丰富度和均匀度	H′=-∑Pi × ln(Pi)	Pi =(Ci-R) / ∑(Ci-R)
丰富度指数 Richness index	表示群落丰富度指数	Ci >0.2	Ci >0.2 则代表该孔碳源被利用，该孔即为反应孔
均匀度指数 Evenness index	通过Shannon 指数计算出的均匀度	E =H / lnS	S 为颜色变化孔的数目
辛普森指数 Simpson index	评估某些最常见种优势度指数	D=N (N - 1) /∑ni (ni-1)	ni是第i孔的相对吸光值(C-R)，N 是相对吸光值总和。
群落丰富度指数 Brillouin index H	评估群落丰富度	H=(1/N)×ln(N!/ n1!n2!n3!...)	ni第i个物种的个体数量，N是所有物体的个体总和。
均匀度指数 McIntosh index	是群落物种均一性指数		ni是第i孔的相对吸光值(C-R)

表选项

2010年与2011年两年试验结果显示，O₃熏气与太阳辐射减弱双因子处理下，土壤微生物对碳源的降解速率(24—96 h降解曲线的斜率)和最终AWCD 值都显著低于CK、T和S1，如图 2所示。这说明，增强的O₃与减弱的太阳辐射两种因素双因子处理对碳源降解速率的抑制效应大于它们的单独作用。单独O₃熏气(T)，土壤微生物对碳源的降解速率、AWCD最大值均显著低于对照。太阳辐射减弱20%单独作用(S1)，土壤微生物对碳源降解速率与CK无显著差异，但AWCD最大值显著降低。结果说明，O₃熏气降低了土壤微生物碳源利用的速率和最终碳源利用总量，太阳辐射减弱20%时对土壤微生物的碳源降解速率没有显著影响，但降低了最终碳源利用总量。

图 2 不同处理土壤平均颜色变化率(AWCD)192h培养期间的变化 Fig.2 AWCD changes of different treatment soils during 192 hours culture on Biolog-eco plates

图选项

采用土壤ELISA反应96 h的数据分析土壤微生物对不同类别碳源的利用强度，从图 3可看出，T，T+S1，T+S2，T+S3处理显著降低了碳源利用总量，S1对碳源总量的利用则没有显著影响。不同类型碳源的利用强度如表 3所示，糖类、氨基酸、羧酸、酚酸和胺类的利用率在T、T+S1、T+S2、T+S3作用下显著降低，S1对它们则没有明显影响。聚合物类的AWCD值较小,说明难以被微生物分解，S1却能显著提高聚合物的利用强度。两年试验变化趋势相同。结果说明，适度的太阳辐射减弱(减弱20%)，一定程度上增加了对聚合物类的分解，O₃浓度单独增加处理，以及O₃熏气和太阳辐射减弱双因子处理下，除了聚合物类以外其它碳源利用率显著降低。增加的O₃和减弱的辐射两因素复合作用比O₃单因素作用对碳源利用强度的抑制效应强。

图 3 O3熏气和太阳辐射减弱下土壤微生物对不同类型碳源的利用 Fig.3 Fraction of utilization for different types of carbon sources by microbes under ozone fumigation and depressed solar irradiance 不同字母表示处理间经Duncan氏多重极差检验差异显著(P < 0.05)

图选项

O₃熏气和太阳辐射减弱条件下，土壤微生物群落功能多样性指数：Simpson指数(D)、 Shannon指数(H′)、McIntosh(Dmc)指数以及Simpson均匀度在两年的试验中均没有显著变化；只有评估微生物丰富度的Brillouin指数(H)比对照及S1处理低(表 4)。可见增强的O₃与减弱的太阳辐射处理，对麦田土壤常见微生物类群影响不大，对不同种类微生物生长繁衍的刺激作用没有很大差异，没有使某些物种大幅度增长或减少，群落均匀性变化不显著。微生物丰富度是否降低还需长期试验观察。

对培养96 h的AWCD数据进行微生物群落功能主成分分析(PCA)，土壤微生物碳源利用功能多样性2010年相关的主成分1(PC1)、主成分2(PC2)依次解释变量方差的70.24%、20.16%，PC1，PC2的累计贡献率达到90.40%；2011年相关的主成分1、主成分2依次解释变量方差的76.17%、12.80%，PC1，PC2的累计贡献率达到88.97%；PC1、PC2是变异的主要来源，可以解释变异的绝大部分信息(表 5)。再将土壤碳利用主成分进行分权计算，并计算出各因子在各主成分上的载荷：载荷=(特征向量×特征值^1/2)² [31]，得到表 6，得出31 种碳源在两个主成分上的载荷值。由表 7可知，2010年，PC1主要综合了15种碳源的信息，分别属于糖类(5 种)、氨基酸(4 种)、羧酸(4 种)、聚合物(1 种)酚酸(1 种)，说明有15 种碳源使土壤微生物群落代谢功能多样性在PC1 上差异显著，决定PC1 的分异。与PC2 显著相关的碳源有6 种，分别属于糖类(5 种)、胺类(1 种)，说明有6 种碳源使土壤微生物群落代谢功能多样性在PC2 上差异显著，决定PC2的分异。2011年，PC1主要综合了15 种碳源的信息，分别属于糖类(6种)、氨基酸(4 种)、羧酸(3 种)、聚合物(1 种)酚酸(1 种)，说明有15 种碳源使土壤微生物群落代谢功能多样性在PC1上差异显著，决定PC1的分异。与PC2显著相关的碳源有3 种，分别属于糖类(2 种)、胺类(1 种)，说明有3 种碳源使土壤微生物群落代谢功能多样性在PC2 上差异显著。由于大气O₃浓度增加和太阳辐射减弱引起土壤中微生物环境出现差异造成15种碳源分解有显著变化。

复杂的大气背景中，多种大气成分相互影响，NASA Goddard报道，臭氧对硫酸化合物的浓度影响很大^[32]。硫酸化合物是重要的负辐射强迫物质，造成到达地面的太阳辐射减少。单文坡等认为,近地面O₃浓度与太阳辐射和气温有很好的相关性^[33],这主要是由于太阳辐射和气温是许多与O₃相关的大气化学或光化学过程的控制因素,而相对湿度可以直接影响大气中自由基的数量,从而对O₃化学产生影响。晴天地表各污染物浓度的变化比较平稳,阴天变化波动较大，这也说明了太阳辐射在近地面大气化学中的重要作用。O₃熏气能使太阳负辐射强迫增强，增强了因太阳辐射减弱而给农田生态带来的负面影响。太阳辐射减弱促进了植物对O₃的化学吸收。两年的定点试验得出，O₃熏气条件下与太阳辐射减弱复合作用均显著降低了不同类型碳源的降解速率和降解总量，糖类、氨基酸类的分解变异度较高。辐射减弱与O₃熏气结合能加剧O₃对碳源分解的抑制作用，O₃与辐射减弱之间存在协同关系。

土壤微生物对大气环境变化的响应受到土壤温度、CO₂、养分利用效率和水分状况等因素的制约^[34]，O₃浓度升高和太阳辐射减弱长期作用引起土壤养分有效性^[35]和水分利用效率的变化将改变土壤微生物最初的响应。O₃与太阳辐射减弱的交互作用，在不同年份差异显著性不同，这可能是土壤微生物异质性的结果。由于长期环境变化对生态系统微生物过程及结果的预测受到有限的生态学信息的制约，很难确定在较长时间尺度上O₃浓度升高和太阳辐射减弱对土壤微生物的作用，更不能进行小尺度向大尺度的推绎，因为在不同的时间尺度土壤微生物对大气环境变化的响应可能很不一致。

大气环境变化对植物根际土壤微生物多样性的影响是通过植物生长代谢间接作用的结果，不仅随着植物类型改变,还随着植物的生长发育过程改变,具有非常强的时空特征^[36]。土壤微生物多样性对大气环境的响应与植物生长发育过程有关。太阳辐射减弱增加了植物对O₃的吸收，加重了O₃伤害，O₃浓度升高与太阳辐射减弱的交互作用加剧了对土壤根际微生物活性的抑制。

表征微生物群落功能多样性的指数没有显著变化，说明O₃熏气条件下与太阳辐射减弱在较短时期内没有改变土壤微生物的群落结构和功能多样性。要确定在较长时间尺度上O₃浓度升高和太阳辐射减弱对土壤微生物多样性的影响，需长期的后续研究。

(1) O₃熏气和太阳辐射减弱条件下，土壤微生物代谢活性下降，不同类型碳源的分解速率、分解总量下降。

(2)辐射减弱20%的单因素作用对碳源的分解没有显著影响，但与O₃结合则能加剧了O₃对碳源分解的抑制作用，O₃与遮荫之间存在协同关系。O₃浓度增加与太阳辐射减弱复合背景下，糖类、氨基酸类的分解变异度较高。

(3) O₃熏气和太阳辐射减弱条件下，表征微生物优势度、均匀度、丰富度的多样性指数在两年试验中没有显著变化，微生物群落结构功能多样性在短期内没有明显影响。