苹果连作障碍又称再植病，即老龄苹果树去除后，在同一块土地上继续栽植苹果树，而后茬苹果树生长受到抑制或病害发生比较严重，导致果品产量低、质量差的现象^[1]。前人研究表明长期连作会使速效磷耗竭，微量元素缺失，土壤肥力下降，有害物质积累，并且还影响土壤微生物数量^[2]。众多学者研究发现在产生连作障碍的土壤中使用有机肥，可以改善根际土壤微生态环境，减轻作物的自毒作用，进而减轻连作障碍现象^{[3, 4, 5]}。西维吉尼亚州阿巴拉契亚果树科研工作站的研究表明堆肥可以减少杂草生长，减少食草动物，增加捕食性节肢动物，抑制真菌的生长，增加了果园生产系统的可持续性^[6]。发酵流体是在淹水条件下由厌氧微生物作用发酵而成的一种有机肥料^[7]，养分全面，对于苹果的产量、品质和改良土壤理化性状都有积极作用^[8]。堆肥和发酵流体均能减轻连作障碍的发生，但二者对连作土壤环境中主要致病因子土壤酚酸、微生物等的研究鲜见报道。

本试验以苹果常用砧木-平邑甜茶为试验材料，研究了不同有机物料的发酵流体以及堆肥产物对连作土壤环境和平邑甜茶幼苗生物量的影响，为更好地利用有机物料防治连作障碍提供理论依据。

试验于2011—2013年在山东农业大学国家苹果工程实验中心进行。试验材料为平邑甜茶，将其种子与细沙混匀，于4℃左右层积30 d，待种子萌动露白后即可在育苗盘中播种育苗。至幼苗长到6片真叶时移栽到外径29 cm、内径25 cm的泥瓦盆中，盆中装满连作土壤7.5 kg。连作土壤采自于泰安市郊区兹窑30年生苹果园，土壤类型为褐土。连作土壤取自距树干80 cm，深5—40 cm的范围内，多点随机取土，混匀。

试验用的发酵流体和堆肥的制作材料为猪粪、鸡粪、羊粪、麦秆(长度约为2—4 cm，含全氮5.47 g/kg、全磷0.51 g/kg、全钾32.52 g/kg、有机质495.33 g/kg)，两种形态有机物料质量配置比例为猪粪∶秸秆=4∶1、鸡粪∶秸秆=4∶1、羊粪∶秸秆=4∶1、猪粪∶鸡粪∶羊粪∶秸秆=3∶3∶2∶2，共8种有机物料。发酵流体的制作：将直径50 cm，高120 cm的白色塑料桶的三分之二埋于地下，将配好的有机物料放入桶中，注水至没过材料，用木棍搅匀，桶口用白色地膜封住，并留有小孔，在自然条件下进行发酵。堆肥进行常规堆制，自然条件下进行发酵。发酵流体和堆肥第一次在4月20日进行制作，6月15日停止发酵并施入盆中，到7月15日进行取样；第二次在6月20日进行制作，8月15日停止发酵并施入盆中，到9月15日进行取样。两种形态有机物料的总用量根据本实验室尹承苗^[9]研究最适为土壤重量的3%，分为3次施用，每次使用1/3(每隔1 d施用1次)。每个处理30盆，每盆栽植2株幼苗，期间进行正常灌溉管理。连作土+猪粪流体设为T1；连作土+猪粪堆肥为T2；连作土+鸡粪流体为T3；连作土+鸡粪堆肥为T4；连作土+羊粪流体为T5；连作土+羊粪堆肥为T6；连作土+混合流体为T7；连作土+混合堆肥为T8；连作土为CK。CK中每千克土施氮1.2 g、磷60 mg、钾8.2 g，其他有机物料处理相对CK速效氮、速效磷、速效钾不足部分由相应化肥(尿素、磷酸二氢钾、氯化钾)补足。3种有机物料及发酵流体和堆肥的养分组成见表 1、表 2。

参照关松荫的方法^[10]，对土壤酶进行测定。

脲酶活性测定 称取5 g土样于50 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，振荡均匀，15 min后加10 mL 10%尿素溶液和20 mL PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24 h。培养结束后过滤，取1 mL滤液加入50 mL容量瓶中，再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。显色20 min，定容。1 h内在分光光度计与578 nm波长处比色。(靛酚的蓝色在1 h内保持稳定)。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差，根据标准曲线求出氨态氮含量。以24 h后1 g土壤中氨态氮含量表示脲酶活性。

中性磷酸酶活性测定 称5 g土样置于200 mL三角瓶中，加2.5 mL甲苯，轻摇15 min后，加入20 mL 0.5%磷酸苯二钠，摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24 h。然后在培养液加入100 mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3 mL滤液于50 mL容量瓶中，每瓶加入5 mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30 min后比色测定。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660 nm处比色。标准曲线绘制：取1，3，5，7，9，11，13 mL酚工作液并显色定容，待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。

蔗糖酶活性测定 称5 g风干土，置于50 mL的三角瓶中，注入10 mL 1%淀粉溶液，再加10 mL pH5.6磷酸盐缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀放入恒温箱，在37℃下培养24 h。培养结束后，将悬液迅速过滤。取滤液1 mL，注入50 mL容量瓶中，加2 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5 min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却。定容后在分光光度计上于波长508 nm处进行比色。用葡萄糖溶液作标准曲线。以24 h后1 g土壤中产生葡萄糖的质量(mg)表示蔗糖酶活性。

微生物的测定采用平板稀释培养计数法^[11]

土壤处理：取10 g新鲜过筛土壤加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶种，封口并将其放在摇床震荡10 min，待土壤分散开混合均匀后，静止20—30 s，即为10^-1稀释液，用移液枪吸取1 mL 10^-1稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，震荡摇匀，即为10^-2稀释液，依次类推，每次更换枪头连续稀释，则制成10^-3、10^-4、10^-5等一系列的土壤稀释液。

细菌的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌的培养采用马丁氏培养基，放线菌的培养采用改良高氏1号培养基。

有机质的测定采用重铬酸钾容量法-稀释热法^[12]

准确称取0.5 g土壤样品于500 mL的三角瓶中，加入1 mol/L(1/6K₂Cr₂O₇) 溶液10 mL，转动瓶子混合均匀，然后加浓H₂SO₄20 mL并缓缓转动1 min，以保证试剂与土壤充分作用，放置约30 min，加水稀释至250 mL，加3—4滴邻啡罗啉指示剂，0.5 mol/L FeSO₄标准溶液滴定至近终点溶液颜色由绿变成暗绿色，直至生成砖红色为止。用同样的方法做空白测定(即不加土样)。

准确称取过12目筛的风干土样100 g样品，加入适量的硅藻土，于烧杯中混匀。在100 mL萃取池底部垫上1片纤维素膜，将混匀的样品装入萃取池中，按优化好的ASE条件萃取：提取溶剂为甲醇和无水乙醇，提取温度为120℃，提取2次，加热5 min，静态提取时间为5 min，吹扫体积为60%，吹扫90 s。萃取完成后，34℃减压浓缩近干，加入1 mL甲醇复溶，过0.22 μm有机相滤膜，待HPLC分析。

色谱条件:色谱柱为Acclaim 120 C₁₈(3 μm，150 mm×3 mm)，柱温 30℃。流动相： A为乙腈，B为水(乙酸调pH值至2.6)，流速0.5 mL/min；进样方式及进样体积：自动进样，5 μL；检测波长280 nm。

试验数据采用Microsoft Excel 2003进行计算和作图，通过SPSS 19.0 软件进行Duncan显著性检测。

由图 1可知，连作土壤施用发酵流体和堆肥初期，流体处理干重与CK相比具有显著性差异。流体与堆肥相比，猪粪的两种处理间有显著性差异。在7月份，表现为：各流体处理高于其堆肥处理且都高于CK。在9月份，表现为：各流体处理高于其堆肥和CK，堆肥处理与CK间无显著性差异。随着时间的推移，平邑甜茶幼苗的干重增加。分析结果表明，与堆肥处理相比，发酵流体处理对于增加平邑甜茶的干重效果更明显，以T1的干重增加效果显著，分别为CK的1.57倍和1.55倍。

由图 1可知，连作土壤施用发酵流体和堆肥初期，流体处理鲜重与CK相比具有显著性差异。流体与堆肥相比较，猪粪的两种处理间有显著性差异。在7月份表现为：各流体处理高于其堆肥处理且都高于CK。在9月份，表现为：各流体处理高于其堆肥处理且都高于CK。随着时间的推移，各处理间的鲜重差异性显著。分析结果表明：与堆肥处理相比，发酵流体处理对于增加平邑甜茶的鲜重效果更明显，以T1的鲜重增加效果显著，分别为CK的1.26倍和1.86倍。

图1 发酵流体和堆肥对平邑甜茶干鲜重的影响 Fig.1 Effect of Fermentative liquid and Compost on dry and fresh weight of Seedling of Malus hupehensis Rehd. under replant 图中的不同字母表示经多重比较检验在α= 0.05水平上达到显著性水平

图选项

图 2可以看出，在7月份除T5、T6处理脲酶活性与CK无显著性差异外，其余处理均高于CK；流体与堆肥处理相比，T4 > T3、T7 > T8，猪粪和羊粪的两种处理间无差异性，鸡粪和混合的两种形态处理间差异性显著，鸡粪堆肥处理最高，为CK的2.94倍。在9月份，除T6处理外，其他处理脲酶活性均高于CK，流体与堆肥处理相比除T3 < T4外，其他发酵流体处理土壤脲酶活性均高于其堆肥处理，猪粪和羊粪的两种形态处理间差异性显著，猪粪流体处理土壤脲酶活性最高位为CK的2.00倍。结果表明：随着时间的推移，猪粪和羊粪发酵流体处理的连作土壤脲酶活性要高于其堆肥处理。

图2 发酵流体和堆肥对连作土壤脲酶活性的影响 Fig.2 Effect of Fermentative liquid and Compost on urease activity of the soil under replant

图选项

如图 3 可以看出，在7月份，各处理土壤磷酸酶活性均显著高于CK，各发酵流体和堆肥处理间无显著性差异。9月份，T1、T3的土壤磷酸酶活性与CK相比具有显著性差异，不同发酵产物相比较，T1 > T2，T3 > T4，且猪粪和鸡粪的两种处理间差异显著，猪粪流体处理最高，为CK的3.52倍，鸡粪流体次之，为CK的2.06倍。

图3 发酵流体和堆肥对连作土壤磷酸酶活性的影响 Fig.3 Effect of Fermentative liquid and Compost on phosphatase activity of the soil under replant

图选项

如图 4可以看出，在7月份，除T4外其他处理连作土壤蔗糖酶活性均低于CK，发酵流体和堆肥两种处理相比，除T7 > T8外，其他发酵流体处理酶活性均低于其堆肥处理，鸡粪的两种形态处理间差异性显著，鸡粪堆肥处理土壤蔗糖酶活性最高为CK的1.05倍。在9月份，除T2、T7外，其他处理均低于CK，两种有机物料处理相比较除T1 < T2外，其他发酵流体处理均高于其堆肥处理，猪粪、鸡粪和混合的发酵流体和堆肥处理差异性显著，猪粪堆肥处理土壤蔗糖酶活性最高为1.90 mg g^-1 24h^-1。

图4 发酵流体和堆肥对连作土壤蔗糖酶活性的影响 Fig.4 Effect of Fermentative liquid and Compost on invertase activity of the soil under replant

图选项

如图 5所示，在7月份各处理细菌数量均高于对照，发酵流体处理与堆肥处理相比较，各流体处理的土壤细菌数量高于相应的堆肥处理，混合发酵流体处理土壤细菌数量最高为CK的1.75倍。在9月份，除T6和T8处理的土壤细菌数量与CK无显著性差异外，其他处理均高于对照，发酵流体处理与其堆肥相比较，流体处理的土壤细菌数量高于相应的堆肥处理，羊粪发酵流体处理土壤细菌数量最高为CK的2.95倍。

如图 6所示，在7月份，各处理土壤真菌数量均高于对照，发酵流体处理与其堆肥处理相比较，猪粪和鸡粪的流体处理的土壤真菌数量高于其相应堆肥处理，而羊粪和混合处理的结果正好相反，羊粪堆肥处理土壤真菌数量最高为CK的2.23倍，到了9月份，除混合处理外，猪粪、鸡粪和羊粪3种流体处理的土壤真菌数量均低于其相应的堆肥处理，混合流体处理土壤真菌数量最高为CK的2.11倍。

如图 7所示，在7月份各处理放线菌数量均高于对照，发酵流体处理与其堆肥处理相比较，流体处理的土壤放线菌数量均高于其相对应的堆肥处理，混合发酵流体处理土壤放线菌数量最高为CK的1.73倍。在9月份，除猪粪处理外，鸡粪、羊粪和混合3种流体处理的土壤放线菌数量均高于其相应的堆肥处理，羊粪发酵流体处理土壤放线菌数量最高为CK的2.37倍。

图5 发酵流体和堆肥对连作土壤细菌的影响 Fig.5 Effect of Fermentative liquid and Compost on bacteria of the soil under replant

图选项

图6 发酵流体和堆肥对连作土壤真菌的影响 Fig.6 Effect of Fermentative liquid and Compost on fungi of the soil under replant

图选项

图7 发酵流体和堆肥对连作土壤放线菌的影响 Fig.7 Effect of Fermentative liquid and Compost on Actinobacteria of the soil under replant

图选项

如图 8所示，在7月份，T5处理土壤有机质含量低于CK，其他各处理高于CK，发酵流体和堆肥相比较，T3 < T4、T5 < T6、T7 < T8。在9月份，T3处理土壤有机质含量低于CK，其余处理高于CK，发酵流体和堆肥相比较，T1 > T2、T5 > T6。从7月份与9月份相比较来看，发酵流体处理的土壤有机质含量增加量要高于堆肥处理，分别为T1增加量1.01 g/kg > T2增加量0.21 g/kg，T5增加量2.42 g/kg > T6增加量0.40 g/kg，T7增加量1.01 g/kg > T8增加量0.20 g/kg。

图8 发酵流体和堆肥对连作土壤有机质含量的影响 Fig.8 Effect of Fermentative liquid and Compost on replant soil organic content

图选项

如表 3中，测定不同有机物料的发酵流体和堆肥处理的土壤中对羟基苯甲酸、丁香酸、香草醛、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、肉桂酸、柚皮素、根皮素10种酚酸类物质的含量，7月份和9月份相比较，酚酸种类数量增加，猪粪流体、猪粪堆肥和鸡粪发酵流体处理酚酸总含量降低，下降比例分别为43.66%、55.84%和46.40%，鸡粪堆肥、羊粪和混合处理酚酸总含量有所升高。对7月份和9月份的各种酚酸类物质进行比较后发现，对羟基苯甲酸在T5、T8和CK3个处理中有所升高，其他处理都降低；丁香酸在T1、T4、T7和CK 4个处理中升高，其他处理均降低；香草醛在T1、T5、T7和CK 4个处理中升高，其他处理均降低；香豆酸在T3、T5和CK 3个处理中升高，其他处理均降低；阿魏酸在T5、T7和CK 3个处理中升高，其他处理均降低；苯甲酸在T5和CK处理中升高，其他处理均降低；根皮苷在T2处理中降低，其他处理中均有所升高；肉桂酸在T2和T3处理中含量降低，其他处理中均升高；柚皮素在T2、T5、T6、T8和CK 5个处理中含量均升高，在其他处理中均降低；根皮素在T2和T4两个处理中含量均降低，在其他处理中含量均升高。发酵流体和堆肥相比猪粪和鸡粪的发酵流体处理的土壤酚酸含量比堆肥处理低，而羊粪和混合的发酵流体处理的土壤酚酸含量比堆肥要高。由上图可知，CK处理中所有酚酸类物质均有所升高，而在发酵流体和堆肥的处理中不用处理对酚酸酸类物质含量影响不同。

已有研究表明，发酵流体和堆肥可以增加作物对养分的吸收，促进作物的生长。施用有机物料发酵流体可使植物产量增加^[13]。本实验在施用发酵流体和堆肥后，平邑甜茶幼苗生物量均呈现增长趋势，其中猪粪流体处理效果最明显。

土壤有机质和土壤酶活性是表征土壤质量和土壤肥力的两个重要指标，其中土壤有机质又是评价土壤质量动态变化的重要指标^[14]。从本实验的结果看，连作土壤中施入不同有机物料的发酵流体和堆肥后，土壤有机质含量均升高，有研究表明许多土壤酶活性与土壤有机质含量存在一定的正相关关系，可用来预测某些营养物质的转化情况以及土壤肥力的演变趋势^[15]。脲酶是土壤中最活跃的水解酶类之一，能水解施入土壤中的尿素，释放出供作物利用的铵离子，脲酶的活性与土壤中有机物质含量、氮的供给与利用情况、土壤微生物量和其它养分含量相关^{[16, 17]}。本试验中脲酶活性升高，其原因可能是土壤中有机质为微生物的生长提供更易利用的碳源、氮源等营养物质，促进了微生物的生长，增加了某些土壤微生物的群体数量^[18]，而微生物数量的增加及其生长速率的增大可有效地促进脲酶的活性，这是因为微生物细胞的增殖和裂解可释放出脲酶，增加土壤中脲酶的含量，这也是土壤脲酶的主要来源^[10]。并且土壤中有机质是脲酶的重要载体，它们能为脲酶发挥作用提供场所^[17]。刘建玲^[19]等研究表明，土壤磷酸酶活性同土壤有机质含量呈极显著正相关，可以表征土壤的磷素营养状况，本试验中磷酸酶结果与其基本一致。土壤蔗糖酶是与土壤中有机碳转化有关的酶类之一，其活性大小可以间接地表征土壤中有机碳的转化情况^[20]。隋跃宇^[21]等研究表明，土壤有机质含量越高，可以维持土壤蔗糖酶保持较高的酶活性水平，本试验结果中从7月到9月各处理有机质含量增加，土壤蔗糖酶活性提高。

土壤微生物在土壤的物质转化和能流中起着重要作用。它参与土壤中有机物质的分解和腐殖质的形成、分解过程，养分转化和循环以及各生化过程^[22]。有机肥的施入不仅改善了土壤的理化性质同时也为也为微生物的生长提供了良好的环境条件和能源^[23]。从本实验结果可以看出，在施入两种形态的有机物料后，连作土壤中的微生物数量发生很大的变化，土壤中的细菌、真菌和放线菌数量增加，随着时间的推移各处理间的差异也越加明显，细菌/真菌比值的增加，有利于调高土壤肥力^[24]，从本试验的细菌/真菌比值中可以看出从7月份到9月份的发酵流体各处理的结果要大于堆肥的各处理结果，土壤微生物菌群结构也逐渐从“真菌型”向“细菌型”转化，7月份羊粪发酵流体处理土壤的细菌/真菌比值最高为4.49，9月份鸡粪发酵流体处理土壤的细菌/真菌比值最高为2.61。从试验结果中可以看出发酵流体对土壤微生物的影响比堆肥明显，原因可能是在温度相同的情况下，发酵流体处理提供了比较湿润的环境更有利于微生物的繁殖。

酚酸化合物通过植物残体分解、 根系分泌等途径进入土壤，可直接影响作物根系细胞膜的特性，或者通过改变土壤微生物类群等，进而对作物生育和代谢产生抑制作用，是使作物产生连作障碍的重要因素之一^{[25, 26, 27, 28]}。有些研究表明，林木连栽、作物连作都会使土壤中的酚类物质逐年增加^[29]，酚类物质的积累在导致连栽林木和连作作物减产方面起到一定的作用^[30]。马云华等^[31]发现，伴随连作年限的增加，日光温室黄瓜连作土壤中酚酸类物质(对羟基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸)明显积累，连作5—9a的土壤酚酸类物质含量显著高于连作1—3a的土壤。而添加有机物料后，可能由于其中携带大量微生物的作用，改善了土壤中的微生物群落结构，进而影响了连作植物的根系分泌物，降低了与连作障碍中自毒物质酚酸的含量^{[32, 33]}。土壤微生物是土壤有机物转化的执行者，对调节化感物质的化感效应具有关键性的作用^[34]，其中土壤酚酸类物质的分解消除主要就是依赖土壤中异养微生物的大量繁殖，而异养微生物的增殖又依赖于土壤碳源和能源的供应，能源和碳源不足将导致微生物初生代谢过程转化为次生代谢，加剧酚酸物质的积累^[35]；另外由于土壤微生物对不同酚酸的分解利用程度不相同，有些酚酸物质在单一微生物作用下就可以分解，而另一些酚酸类物质则需要多种微生物的共同作用才能分解^[36]。不同的土壤环境具有不同区系的微生物，一些细菌以酚酸类物质作为专一性能源物质进行自身繁殖^[37]，本试验中发酵流体和堆肥两种有机物料处理的连作土壤中微生物数量明显升高，酚酸总量从表 3中可以看出猪粪和鸡粪的处理明显降低，而羊粪和混合处理却升高，可能与羊平时以植物为食物有关系。通过酚酸类各物质的含量变化中可以看出，CK处理中各酚酸类物质含量均升高，而其他处理中各酚酸类物质含量变化升降不一，可能是由于各处理的土壤中微生物区系不同所造成的，微生物对酚酸类物质的特性降解还有待进一步的研究。

发酵流体和堆肥的施入均增加了平邑甜茶幼苗的生物量，提高了土壤酶活性，增加了土壤微生物数量，提高了细菌和真菌的比值，使土壤微生物菌落结构向 “细菌型”转化。从整体效果来看，发酵流体处理比堆肥明显，其中猪粪发酵流体比其他3种流体效果明显。对于土壤酚酸含量的影响，各处理都不同程度地降低了土壤中酚酸类物质的含量。