在我国每年用作饲料添加剂的抗生素已超过8000t^[1]，养殖业通常利用抗生素提高饲料利用率、牲畜的增重率以及预防和治疗牲畜疾病^[2]，因为过量添加，大部分抗生素不能被动物吸收，最终以母药的形式随粪便和尿液排出^[3]。抗生素的滥用、过量使用，甚至人药兽用，使得抗生素的环境危害和生态风险越来越大。研究者已从浙江、广西、杭州、北京、济南等多个省市的养殖场畜禽粪便中检测出抗生素^{[4, 5, 6, 7]}。此外，市政污水、河流水、湖泊水、沉积物和土壤，甚至地下水中均检测出抗生素残留^{[8, 9]}。抗生素抗性基因作为抗生素污染的次生污染物，已在包括河流、污水厂排水等多个水体中检测出来^{[10, 11]}，由于其可能通过水平迁移等途径实现生物间传递，而人们对其具体的环境行为仍有非常多未知的领域，也吸引了越来越多学者的关注。目前主要的研究集中在抗生素对环境受体的影响^[12]及抗生素在水环境、土壤环境以及污染治理设施中的降解情况研究等^{[13, 14, 15, 16]}。

重金属污染由于来源广泛，且具有生物累积性、长期性和不可逆性，一直以来备受关注。作为两种备受关注的污染物，重金属和抗生素复合污染的现象也越来越普遍，如畜禽养殖的固废和废水、施用粪肥的土壤环境等^{[4, 17]}。目前，有关重金属和抗生素复合污染的研究主要集中在重金属和抗生素在环境中的分布、含量上的分析及对污水处理的影响^{[17, 18]}，而重金属对抗生素抗性的影响未做系统性研究，随着人们从环境中筛选出越来越多同时具有重金属抗性和抗生素抗性的菌种，如从鱼、虾体内及沉积物中分离的气单胞菌属(Aeromonas spp.)等^{[19, 20]}，及从南极海水中分离的莫拉氏菌属(Moraxella)、产碱杆菌(Alcaligens)和假单胞菌(Pseudomonas)等嗜冷菌^[21]，重金属和抗生素抗性间的相关性也引起了学者的关注，研究发现重金属和抗生素的联合毒性表现为拮抗作用和相加作用^[18]。

养殖废水作为一种典型的重金属和抗生素复合污染环境，其抗生素浓度范围多为μg/L级，有些可达到1—6mg/L，而重金属以Cu²⁺、Zn^2＋最高，在猪粪中可达几百mg/kg^{[4, 22, 23]}，为了准确了解重金属胁迫对菌体抗生素抗性的响应特点，本试验从中筛选获得1株优势菌Pseudomonas alcaligenes LH7，研究3种典型重金属(Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺)在不同浓度下对菌株抗生素(红霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)抗性的影响，从而为微生物法治理重金属和抗生素复合污染提供理论基础。

本实验菌株从广州某养猪场废水处理系统中分离获得，为1株革兰氏阴性杆菌，细杆状，无芽孢，能运动，菌落呈圆形，无色，光滑不透明，色氨酸脱氢酶、V-P测定、硝酸盐还原、接触酶、氧化酶反应呈阳性，不能利用葡萄糖、蔗糖、果糖，经鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes LH7)。对照菌株为大肠杆菌K-12，质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠杆菌ATCC 35218。

(1)菌种的活化和培养、菌悬液的制备、抗生素敏感实验分别采用牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、MH琼脂培养基。

(2)试验培养基：分别称取定量的分析纯CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄和K₂Cr₂O₇，以无菌去离子水定容,再用0.22 μm膜过滤，配制成浓度为1×10⁴ mg/L的重金属标准溶液，作为储备液，用于调节培养基中重金属浓度。将灭菌(121 ℃，1.0 MPa)后的MH琼脂培养基冷却至50 ℃左右，加入不同量的重金属储备液，调节重金属浓度。摇匀后，倒入培养皿待凝固，用于菌体的重金属MIC测定及重金属对菌株抗生素抗性影响研究。

挑取冰箱中甘油保存的菌种，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在生化培养箱中37 ℃培养24 h活化，从平板上挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，于37 ℃恒温振荡器培养16—18 h获得种子培养液；按照5%的接种量，接种到新鲜培养液中，继续37 ℃恒温振荡器培养16—18 h，获得浓度为10⁸ CFU/mL的菌悬液，用于重金属最小抑制浓度MIC测定及抗生素抗性研究。

采用琼脂稀释法，用涂布棒将100 μL菌悬液涂布到含重金属溶液的试验培养基上，Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺的浓度变化范围为0—200 mg/L,置于生化培养箱恒温37 ℃培养24 h，观察菌的生长情况。以大肠杆菌K-12为对照菌株，MIC的终点判断标准为抑制细菌生长的最低浓度。

采用K-B纸片扩散法做抗生素耐药试验，实验规程按美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准进行操作。由于该菌株为革兰氏阴性菌，本实验选用四种常见并针对革兰氏阴性菌的抗生素，分别为红霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、头孢拉定(30 μg/片)、四环素(30 μg/片)，药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司，直径为6 mm，于-20 ℃保存。以大肠杆菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853,大肠杆菌ATCC 35218为质控菌株。

本试验设计抗生素浓度一定时，即红霉素(15 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、头孢拉定(30 μg/片)、四环素(30 μg/片)，不同浓度的重金属对菌株的抗生素抗性的影响。移取100 μL菌悬液滴加至含重金属的试验培养基上，涂布均匀。15 min后，用小镊子夹取药敏纸片贴在涂好菌液的培养基上，每个平板上贴3片，每个实验设置3个平行样，于37 ℃培养箱中培养16—18 h，测量抑菌圈直径。

采用SPSS 17.0软件，以抗生素种类、重金属种类和重金属浓度为固定因子，抑菌圈直径为因变量，对数据进行单变量多因素方差分析，显著性水平为0.05。抑菌圈直径变化率k=(b-a)/a (a为未添加重金属时抑菌圈直径，b为添加重金属后抑菌圈直径)。采用Origin 8.1软件绘制不同浓度Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺ 对四种抗生素抗性影响的柱形图。

本研究采用最小二分法确定Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺的最小抑制浓度分别为125、125、100 mg/L。根据重金属的MIC值，重金属和抗生素交叉抗性试验中选取重金属Cu²⁺和Zn²⁺的浓度梯度为0、0.1、2、10、50、100 mg/L，Cr⁶⁺的浓度梯度为0、0.1、2、20、50、80 mg/L。

根据美国临床和实验室标准协会中药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准，以R(耐药)、I(中介)、S(敏感)表示，该菌株对红霉素、阿莫西林、头孢拉定和四环素4种抗生素的敏感程度见表 1，发现该菌株对阿莫西林和四环素有抗性，而对头孢拉定敏感。

方差分析发现重金属种类和浓度对抑菌圈直径影响显著(F_种类=18.370，P_种类<0.05；F_浓度=47.335，P_浓度<0.05)。另外，抗生素种类×重金属种类、抗生素种类×重金属浓度、重金属种类×重金属浓度之间的二维交互效应对抑菌圈直径也有极为显著的影响(P<0.05)，甚至抗生素种类×重金属种类×重金属浓度之间的三维交互效应对抑菌圈直径也有极为显著的影响(F=32.605，P<0.05)(表 2)。这表明对于菌株的抗性影响因素，除抗生素种类、重金属种类和重金属浓度主因子外，抗生素种类×重金属种类、抗生素种类×重金属浓度、重金属种类×重金属浓度之间的二维交互效应以及抗生素种类×重金属种类×重金属浓度之间的三维交互效应也不可忽略，重金属和抗生素存在交互作用，即重金属胁迫对细菌抗生素抗性响应有影响。

由图 1—图 3可知，重金属的加入对细菌的抗生素抗性有不同程度的影响。从抑菌圈直径相对变化率来看，重金属的加入对菌体四环素抗性的影响最为明显，而对头孢拉定的影响最不明显。随着共存Cu²⁺浓度升高，四环素抑菌圈直径与空白相比，变化率也不断增大，分别为115.32%(0.1 mg/L Cu²⁺)，161.56%(2 mg/L Cu²⁺)，162.14%(10 mg/L Cu²⁺)，171.97%(50 mg/L Cu²⁺)，174.28%(100 mg/L Cu²⁺)，而头孢拉定抑菌圈直径变化率范围在 -16.80% — +11.26%；Zn²⁺共存时，菌体四环素抑菌圈直径变化率分别为170.81%(0.1 mg/L Zn²⁺)，-100.00%(2 mg/L Zn²⁺)，-100.00%(10 mg/L Zn²⁺)，134.54%(50 mg/L Zn²⁺)，140.03%(100 mg/L Zn²⁺)，而头孢拉定抑菌圈直径变化率范围很小，在 -9.12% — 34.65%之间； Cr⁶⁺ 共存使得菌体四环素抑菌圈直径的变化率分别为 -100.00%(0.1 mg/L Cr⁶⁺)，7.80%(2 mg/L Cr⁶⁺)，-100.00%(20 mg/L Cr⁶⁺)，-100.00%(50 mg/L Cr⁶⁺)，-100.00%(80 mg/L Cr⁶⁺)，而头孢拉定抑菌圈直径的变化率明显随着Cr⁶⁺ 浓度的升高而逐渐增大，分别为1.26%(0.1 mg/L Cr⁶⁺)，15.65%(2 mg/L Cr⁶⁺)，22.30%(20 mg/L Cr⁶⁺)，40.91%(50 mg/L Cr⁶⁺)，53.32%(80 mg/L Cr⁶⁺)。

图 1 Cu2+对抗生素抗性的影响 Fig.1 Effect of copper on antibiotic resistance

图选项

图 2 Zn2+对抗生素抗性的影响 Fig.2 Effect of zinc on antibiotic resistance

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图 3 Cr6+对抗生素抗性的影响 Fig.3 Effect of chrome on antibiotic resistance

图选项

重金属对细菌抗生素抗性的影响主要表现为促进作用和抑制作用，即重金属和抗生素间的交互作用表现为协同抗性和协同杀菌，且随重金属种类和浓度的不同而改变，可将交叉抗性组合分为3种类型。第1种，低浓度的重金属离子与抗生素共存表现为协同抗性，而高浓度重金属离子与抗生素共存表现为协同杀菌，如Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与红霉素，Cu²⁺与头孢拉定。低浓度的Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与红霉素共存时，测得的抑菌圈直径均小于空白组的抑菌圈直径15.41mm，即低浓度的Cr⁶⁺ 和Zn²⁺使得菌株红霉素抗性增强，Cr⁶⁺或Zn²⁺与红霉素之间表现为协同抗性；而高浓度的Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与红霉素共存时，菌株红霉素抗性减弱，此时Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与红霉素之间表现为协同杀菌。第2种，与第1种类型相反，即高浓度的重金属离子与抗生素共存表现为协同抗性，而低浓度重金属离子与抗生素共存表现为协同杀菌，如Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林。低浓度的Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林共存时，测得抑菌圈直径均大于空白组的抑菌圈直径7.95 mm，即低浓度Cr⁶⁺ 或Zn²⁺使得Pseudomonas alcaligenes LH7对阿莫西林的抗性减弱，Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林之间表现为协同杀菌；而高浓度的Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林共存时，菌株对阿莫西林的抗性增强，此时Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林之间表现为协同抗性。这两类抗性组合都存在重金属折点浓度，且因抗性组合而异。如与阿莫西林共存时，Cu²⁺、Cr⁶⁺ 的折点浓度50 mg/L，而Zn²⁺的折点浓度为10mg/L。第3种，菌体的抗生素抗性变化只与重金属种类相关，如Cu²⁺的共存导致菌体的四环素抗性减弱，敏感性从R变成S，类似的还有Cu²⁺与阿莫西林及Cr⁶⁺与头孢拉定，而Cu²⁺的共存导致菌体的红霉素抗性明显增强，敏感性从I变成R(表 3)。

从养殖废水中筛选出的菌株Pseudomonas alcaligenes LH7具有重金属(Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺)抗性和抗生素(红霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)抗性，菌体的重金属抗性强弱顺序为Cu²⁺ = Zn²⁺ > Cr⁶⁺ 。Matyar等^[23]也从海水及沉积物中分离得到具有重金属和抗生素抗性的假单胞菌，发现菌体的重金属抗性强弱顺序为Cu > Cd > Mn > Zn > Cr > Pb，且同时对多种抗生素表现出抗性^[24]。对于菌体同时具有重金属和抗生素抗性的原因，可能是与许多抗生素和重金属抗性基因位于相同的移动遗传元件(MGEs)，如质粒、转座子和整合子有关^[2]。

重金属种类和浓度对菌株的抗生素抗性有很大影响(P<0.05)。重金属和抗生素的交互作用主要表现在协同抗性和协同杀菌。具有协同抗性的抗性组合有Cu²⁺与红霉素，低浓度的Cr⁶⁺ 、Zn²⁺与红霉素及高浓度的Cr⁶⁺ 、Zn²⁺与阿莫西林。孙建平等^[18]研究了抗生素和重金属联合毒性作用下对发光细菌的影响，发现金霉素与Cu(Ⅱ)存在拮抗作用，金霉素的抑制作用随Cu(Ⅱ)浓度的增加而减小。协同抗性是指重金属抗性基因和抗生素抗性基因定位于同一个遗传元件上，如质粒、转座子或整合子，通过转化、质粒消除和质粒测序方法已经证明重金属和抗生素抗性基因常常定位于质粒上^{[25, 26]}。除了基因上的联系，重金属与抗生素之间的吸附作用、络合作用也可能是其协同抗性的原因。Jia等^[27]研究发现重金属铜和四环素共存时，会影响它们在土壤上的吸附行为，四环素增加了Cu在两种土壤上的吸附量。Hlzel等^[28]研究发现锌离子与四环素会形成稳定的络合物，锌离子会抑制肠道对四环素的吸收，使得瞬时肠道(及排泄的)中的四环素浓度瞬时增大。而这种螯合作用对母药的抑菌效力的影响还有待进一步研究。

而具有协同杀菌作用的抗性组合有Cu²⁺与四环素或阿莫西林，Cr⁶⁺ 与头孢拉定，低浓度的Zn²⁺与阿莫西林以及高浓度的Cu²⁺与头孢拉定，Zn²⁺与四环素。相类似地，孙建平等研究发现金霉素与Zn(Ⅱ)之间为相加作用^[18]。在重金属、外源性化合物、有机溶剂的选择压力下，细菌的抗生素抗性基因会受到影响^[29]。某些金属(例如Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni和Zn)是必要的，作为微量营养素，用于氧化还原过程，以通过静电作用稳定分子，作为多种酶的组成部分和调节渗透压^[30]。有研究表明重金属会引起亚致死损伤，这可能会增加细菌对抗生素的敏感性^[28]。另外，同一交叉抗性组合在低浓度和高浓度的表现出的作用类型有所不同，可能有3种原因，第一，不同浓度重金属的毒性不同，低浓度的重金属可作为微量营养素刺激微生物生长，高浓度的重金属与酶或DNA结合，或产生氧自由基发生Fenton反应，表现为毒性增强，抑制微生物的生长繁殖，延长微生物的增代时间，如0.5 mM的Zn²⁺可以抑制大肠杆菌的生长，10 mM浓度的Zn²⁺可以减少大肠杆菌的存活^{[31, 32]}。所以，在低浓度表现为协同抗性，高浓度表现为协同杀菌。然而，某些重金属既有毒性，又有致突变性，如Cr⁶⁺ 会引起细菌DNA码组错位突变和碱基对替换^[33]，这就使得高浓度的Cr⁶⁺与阿莫西林表现为协同抗性。第二，重金属与抗生素间的络合作用，如重金属阳离子与四环素类抗生素间的配合作用^[34]，铜(Ⅱ)，镍(Ⅱ)，钴(Ⅱ)与头孢拉定的氨基和羰基形成络合物^[35]。由于形成的络合物对细菌的影响还不明确，有以下3种可能：(1)络合物无毒性；(2)络合物低毒性；(3)络合物高毒性。四环素与Zn²⁺ 共存时，四环素抗性随Zn²⁺浓度的增大表现为先减弱后增强再减弱，可能是由于Zn²⁺与四环素形成的络合物无毒或低毒，在低浓度时，以抗生素和重金属的毒性为主，在一定范围的高浓度，以络合作用后四环素或重金属的毒性为主，超过临界浓度时，则以重金属的毒性为主。第三，与抗生素的种类有关，种类不同，抗菌作用机制也不同。红霉素和四环素主要抑制蛋白质的形成，阿莫西林和头孢拉定则抑制细胞壁的合成。细菌的耐药作用可能需要某些重金属的参与，如Zn²⁺与阿莫西林共存时，阿莫西林属β-内酰胺青霉素类抗生素，产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一，其中金属β-内酰胺酶为β-内酰胺酶中的一类，需要金属离子Zn²⁺作辅因子^[36]。此外，微生物的不同发育阶段对重金属敏感性不同^[32]，失活的菌体对某些重金属还具有一定的吸附作用或还原作用，如Cr⁶⁺，有研究发现用失活的黑曲霉吸附水体中的Cr⁶⁺ 时，发现吸附在菌体上的铬大部分以Cr³⁺ 存在，说明失活菌体对在吸附Cr⁶⁺ 的过程中还有较好的还原作用^[37]。因此，重金属的浓度与抗生素抗性之间有着很复杂的关系。

(1)从养殖废水分离出的革兰氏阴性杆菌Pseudomonas alcaligenes LH7具有3种重金属抗性和4种抗生素抗性，对重金属抗性强弱顺序为Cu²⁺ = Zn²⁺ > Cr⁶⁺ 。

(2)重金属作用下，对菌株的抗生素抗性有显著影响。抗生素种类、重金属种类和重金属浓度、抗生素种类×重金属种类、抗生素种类×重金属浓度、重金属种类×重金属浓度之间的二维交互效应以及抗生素种类×重金属种类×重金属浓度之间的三维交互效应对抑菌圈直径有极为显著的影响(P<0.05)。重金属的加入对四环素抗性的影响最为明显，而对头孢拉定的影响最不明显。

(3) 重金属和抗生素的交互作用主要表现为协同抗性和协同杀菌，浓度对交叉抗性组合的影响主要分为3种类型。在低浓度表现为协同抗性，高浓度表现为协同杀菌的抗性组合有Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与红霉素，Cu²⁺与头孢拉定；在低浓度表现协同杀菌，高浓度表现为协同抗性的抗性组合有Cr⁶⁺ 或Zn²⁺与阿莫西林；菌体的抗生素抗性变化只与重金属种类相关的抗性组合有Cu²⁺与四环素或阿莫西林或红霉素，Cr⁶⁺与头孢拉定。