随着人类社会不断发展，对能源的需求量越来越大，已导致石油等化石能源紧缺，能源危机问题突显。寻求洁净的可再生能源成为目前的一个重要研究领域。生物柴油作为石油的替代品具有巨大的应用潜力，已引起了广泛关注^{[1, 2, 3]}。

利用微藻资源生产生物柴油具有多方面的优点，如光合效率高，生长速度快，培养周期短，不需要占用大量耕地，而且细胞结构简单，通过生物技术手段易于改造，油脂组成符合生物柴油生产的要求等。因此，微藻也被认为是最有潜力的生物柴油生产原料^[4]。

目前，关于微藻的选育已有一些报道^{[5, 6, 7]}。谷皮菱形藻(Nitzschia palea)隶属于硅藻门(Bacillariophyta)，菱形藻科(Nitzschiaceae)，广泛分布于江河湖海等各种水体中，为广盐性藻种^[8]，是一种在水产养殖方面极具经济价值的种类^[9]。作者在前期研究中已发现该种具有生长速度快、油脂产率高的特点，是一种较理想的高脂藻种^[10]。

硅藻内部的理化成分与其生长的环境相关^{[11, 12]}，温度、光强、pH、培养基成分等的改变都会影响细胞内部脂质含量与组成。利用各种培养条件的优化，可以实现藻细胞内部油脂含量的提升。本文以作者前期筛选的一株高脂谷皮菱形藻为研究对象，进行了温度、光强和培养基中N源、P源、Si源的用量对该藻生长量及中性脂积累量的逐级优化，以期为开发微藻生物柴油种质资源提供依据。

谷皮菱形藻(Nitzschia palea NY025)，分离自山西省汾河上游，为作者前期筛选到的具产油潜力藻株。将实验材料接种至D1培养基进行扩大培养，至对数期时进行后续实验。正交实验中，通过在D1培养基中添加相应量的N源、P源、Si源对该藻株进行优化培养。

开启紫外可见分光光度计进行联机操作。取谷皮菱形藻藻液，以D1培养基为对照，进行最大吸收峰的波长扫描，得到最大吸收波长为675nm。选取同一时期不同浓度的藻液，使用血球计数板计数，测定不同浓度藻液OD₆₇₅值，以OD₆₇₅为纵坐标，细胞浓度为横坐标，生成相关性曲线，并建立细胞密度与OD₆₇₅之间的回归方程。

设置5个温度梯度，即15，18，20，22，25℃，考察不同温度对谷皮菱形藻生长及中性脂积累的影响。取生长至对数期的藻液，接种至含D1培养基的20 mL试管中，初始接种OD₆₇₅= 0.07±0.01，置于不同温度的微电脑光照培养箱(SPX-250B-G型，上海博讯)中静置培养，光强为120 μmol m^-2s^-1，光暗比12h ∶ 12h，每日摇动数次。每个测定设3个重复。

生长量测定方法：自接种日起，取240μL藻液加入透明的96孔酶标板中，使用酶标仪检测藻液在OD₆₇₅处的吸光值；中性脂含量测定方法^{[13, 14]}：取240μL藻液加入黑色96孔酶标板中，加入1μL尼罗红染液，混匀后37℃黑暗孵育10min，使用酶标仪检测598nm激发光，543nm散发光处的荧光强度，扣除未接藻的培养基染色后的荧光强度。绘制谷皮菱形藻生长及中性脂积累变化曲线，并通过比较相对吸光值及荧光值增长量得到最佳培养温度。之后在该温度下，进行下一步光照强度的优化。

相对吸光值增长量=(OD_{675 8}－OD_{675 1})/7

式中,OD_{675 8}为培养第8天时藻液吸光值，OD_{675 1}为接种时藻液吸光值。

荧光值增长量=(L₈－L₁)/7

式中,L₈为培养第8天时藻液荧光值，L₁为接种时藻液荧光值。

设置3个光强梯度，120、160、200 μmol m^-2s^-1，考察不同光强对谷皮菱形藻生长及中性脂积累的影响。取一定量的藻液，接种至含D1培养基的20 mL试管中，初始接种OD₆₇₅=0.125±0.01，置于不同光强的培养箱中培养，温度为20℃，每个测定设3个重复。生长量与中性脂含量变化测定方法同1.2.2。选用中性脂积累量最大时的光强，进行下一步实验。

N源、P源、Si源分别选用NaNO₃、K₂HPO₄与KH₂PO4、Na₂SiO₃·9H₂O。根据文献^{[12, 13]}并基于D1培养基配方，设计N、P、Si三因素三水平正交实验(表 1)。实验选用L₂₇(3¹³)正交设计表(表 2)。配制27组添加不同含量N、P、Si的培养液。取对数期的藻液，离心并用各组培养基清洗两次，再将离心收集的材料分别接种于对应的培养基中，每组设3个平行。置于光照培养箱中培养，光强为200 μmol m^-2s^-1，温度为20℃。

测定藻株在不同培养条件下的吸光值与荧光值增长量，绘制相应曲线。吸光值增长量=(OD_{675 10}－OD_{675 1})，OD_{675 10}为培养第10天时藻液吸光值，OD_{675 1}为接种时藻液吸光值，荧光值增长量=(L₁₀－L₁)，L₈为培养第10天时藻液荧光值，L₁为接种时藻液荧光值。参照相关文献^[15]对结果进行方差分析，得出谷皮菱形藻生长及中性脂积累的最优N、P、Si水平组合。

谷皮菱形藻藻液的波长扫描显示(图 1)，在675nm处存在最大吸收峰。且在60s内，谷皮菱形藻沉降不明显(图 2)，短时间内不影响吸光值的测定。谷皮菱形藻的细胞密度与光密度OD₆₇₅之间，存在良好的线性关系(图 3)，相应的回归方程为OD₆₇₅=0.10179C－0.00247，线性相关系数为R₂=0.99782。因此可通过测定OD₆₇₅来间接表示细胞密度，进而表征藻株生长状况。

图 1 谷皮菱形藻的光谱扫描图 Fig.1 Spectrum of Nitzschia pale

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图 2 OD675随时间的变化曲线 Fig.2 Absorbance curves change with time

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图 3 吸光度与细胞密度的标准曲线 Fig.3 Standard curve of absorbance with cell density

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图 4显示了不同温度下，谷皮菱形藻的生长情况。可以看出谷皮菱形藻在各个温度条件下均能生长，但生长速度有一定差异。5个温度梯度下的吸光值增长量，可以看出藻株的生长量先上升后下降，在20℃时达到最大。

图 4 温度对谷皮菱形藻生长及中性脂含量的影响 Fig.4 Effects of temperature on growth and neutral lipid content of Nitzschia palea

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图 4显示了不同温度下，谷皮菱形藻的荧光值变化情况。可以看出荧光值含量变化不大。5个温度梯度下的荧光值增长量，结果显示，藻株中性脂含量先升高后下降，在20℃下中性脂产量最大。

图 5显示了在120、160、200 μmol m^-2s^-1光强下，谷皮菱形藻的生长情况。可以看出谷皮菱形藻在不同光强下的生长趋势相似，生长速度差异不大。3个光强梯度下的吸光值增长量，可以看出藻株在160 μmol m^-2s^-1时生长量达到最大。

图 5 光照强度对谷皮菱形藻生长及中性脂含量的影响 Fig.5 Effects of light intensity on growth and neutral lipid content of Nitzschia palea

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图 5显示了不同光强下，谷皮菱形藻的荧光值变化情况。可以看出荧光值含量随着时间的延长而增加。3个光强梯度下的荧光值增加量，结果显示，在200 μmol m^-2s^-1时中性脂产量最大。

由正交实验结果(表 2)可以看出，对于藻株吸光值增长量来说，极差R_N＞R_P＞R_Si，即N含量对藻株生长影响最大，其次为P，最后是Si，对于T值来说，N₂P₁Si₁最大，因此最佳组合为N₂P₁Si₁，即N、P、Si浓度分别为80、120 、100 mg/L时，谷皮菱形藻生长量最大。而对于藻株荧光值增长量来说，极差值R_N＞R_Si＞R_P，即N对中性脂积累影响最大，Si次之，P影响最小，根据t值可知，N₂P₁Si₃最大，因此最佳组合为N₂P₁Si₃，即当培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、50 mg/L时，谷皮菱形藻的中性脂积累最多。

根据正交实验结果，进行了方差分析，N、P、Si对谷皮菱形藻生长影响的方差分析如表 3所示。由结果可知，F_N、F_P、F_Si、F_N×P、 F_P×Si均大于F_α，因此N、P、Si三因子以及交互作用下N×P与P×Si作用均为显著，因子N×Si作用不显著。各因素的最优水平为N₂P₁Si₁，此时谷皮菱形藻生长量达到最大。表 4中的结果显示了N、P、Si对谷皮菱形藻中性脂产量影响的方差分析，F_N、F_Si、F_N×P、 F_N×Si均大于F_α，因此因子N、Si及交互作用下N×P、N×Si的作用均为显著，因子P与P×Si作用不显著，N₂P₁Si₃的均值最大，为最有利于中性脂积累的水平组合。

谷皮菱形藻最大吸收峰的波长为675nm，藻液细胞密度不同，其色素含量也不同，因而吸光值也有差异^[16]。由研究结果可知，细胞密度与光密度OD₆₇₅之间，存在良好的线性关系，因此利用光密度法代替细胞计数来表征谷皮菱形藻生物量是可行的，且该方法操作步骤简单，数据准确，有利于高通量样品的计数。本文使用尼罗红荧光染色法来间接表示细胞中性脂的含量，无需对样品进行干燥、破碎，操作简单，尤其适用于高通量样品的测定，需要注意的是操作应在较暗环境下进行，以防荧光淬灭。

培养温度的变化对藻细胞生长与脂质积累都有较大的影响。本文研究结果显示在温度为20℃时，最有利于谷皮菱形藻生长量与中性脂的积累，这与陈书秀等^[17]的研究结果是一致的。Renaud^[18]也报道过，在20℃时最适于小新月菱形藻Nitzschia closterium与铲状菱形藻N. paleacea的生长与脂质积累，这是由于温度过高或过低都将影响藻细胞内各种酶的活性，温度最适时，酶活性最高，此时细胞生长与脂质积累达到平衡。最佳生长和脂质积累温度是20℃，也提示我们，在进行谷皮菱形藻大量培养时，不仅可以采用密闭式光反应器培养，也有可能在合适的季节进行室外开放式跑道池培养，以降低成本。

本文的研究结果显示，在光强为160 μmol m^-2s^-1时最有利于谷皮菱形藻的生长，而中性脂积累的最佳光强要高于此值。早在1974年Orcutt就发现，高光强能促进Nitzschia closerium细胞内甘油三酯的合成^[19]，其他学者也有类似报道^{[20, 21]}，可见适当增加光强可以有效促进中性脂的积累。有报道指出微藻中性脂大量积累一般发生于稳定期^[22]，即晚于细胞增殖最快的对数期，这也提示人们在实际应用中可以采用两步培养法，先在光强160 μmol m^-2s^-1下培养，以使细胞大量增殖，而后再增加光强培养，以使中性脂得到大量合成。

正交实验的分析结果显示，对于藻细胞生长，N元素影响最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P与P×Si对藻株生长作用均为显著，因此在藻株培养过程中，三因子都应该重点考虑。N、P、Si浓度分别为80、120、100mg/L时，生长最好。对于中性脂积累，N影响最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均为显著，因此基于中性脂积累的藻株培养中，N、Si应优先考虑。N、P、Si的含量分别为80、120、50 mg/L时，最利于藻细胞中性脂积累。N缺乏与Si缺乏在一定程度上可以增大中性脂的积累，可能是因为氮素的缺乏导致蛋白质合成的减少，从而使代谢途径朝脂肪和碳水化合物方向发展，而Si的缺乏被认为是促使某种合成脂质的酶活性增强，导致脂质含量增加^[23]。这也再次提示我们，在采用两步培养时，可以先以细胞增殖为目的，而后再降低Si浓度，以增加脂质合成。

(1)谷皮菱形藻在675nm时，细胞密度与光密度OD₆₇₅之间，存在良好的线性关系，利用光密度法表征谷皮菱形藻生物量步骤简单，数据准确，有利于高通量样品的计数。采用尼罗红荧光染色法间接表示细胞中性脂的含量，无需对样品进行干燥、破碎，操作简单，适用于高通量样品的测定。

(2)谷皮菱形藻在20℃，光强160 μmol m^-2s^-1时生长最快，在20℃，光强200 μmol m^-2s^-1时，最有利于脂质积累。

(3)培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、100 mg/L时，有利于谷皮菱形藻细胞生长，其中，N元素影响最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P与P×Si对藻株生长作用均为显著。培养基中N、P、Si浓度分别为80、120、50 mg/L时，利于中性脂积累，其中，N元素影响最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均为显著。

(4)可采用两步培养法，先使谷皮菱形藻细胞大量增殖，而后适当改变培养条件，以增加脂质合成。