尾矿废弃地因为物理化学上的一些不良特性而大多成为荒芜之地，废弃物(尾矿废渣和酸性矿山废水)的排放及堆存不仅破坏和占有大量的土地资源，而且导致区域(表层土壤、地表水、地下水)重金属污染^{[1, 2]}。由于尾矿砂颗粒细小，易随风飘散，因此更能造成辐射式扩张性污染。长期以来，由于金属矿废弃地的土壤较为贫瘠，植被自然恢复缓慢，生态问题尤为严重。当前对尾矿山的改造提出了多种模式，取得了良好的效果。在研究中发现，微生物在恢复过程中起到了不可替代的作用。

氮素是植物生长必需的矿质元素,也是需求量最大的矿质元素^{[3, 4]}，而铁尾矿中有效氮含量较低^[5]，所以需要借由固氮菌将空气中的氮气接转化为植物可以利用的氮素。从生态学的角度看，污染土壤生态修复研究的核心内容仍然是超积累植物和高效降解微生物的筛选及合理搭配、修复机理的探索和基于植物与微生物联合修复的根际圈效应、以广义生物修复为核心的联合修复以及修复强化措施的研究。因此固氮菌可有效改善土壤环境，增加土壤有机质含量，促进植物根系对氮元素的吸收，能增强宿主植物的抗病性和抗逆性^{[6, 7]}。由于铁尾矿砂基质条件恶劣，常用固氮菌很难在这样的条件下生存并发挥作用，同时微生物功能存在种间差异，筛选高效土著固氮菌成为了对于尾矿砂植被恢复起到关键作用。

铁尾矿是选矿厂在特定经济技术条件下，将矿石经粉碎，浮选中矿、精矿后余下的微粒状固体粉末^[8]。是土壤元素匮乏、养分贫瘠的一类特殊基质。土壤微生物是土壤形成必不可少的生物成分。研究表明固氮菌数量在微生物的总数中处于绝对优势地位^[9]，充分说明了从铁尾矿中分离出具有高效固氮活性的固氮菌株是完全具有可能性的。但目前在铁尾矿中成功筛选分离固氮菌的研究尚未见报道。为此，本文尝试铁尾矿不同树种恢复模式土壤中固氮菌的筛选和分离，为后续的固氮菌与植物互作机制7及其固氮菌对植物的固氮贡献、对尾矿的改良机制研究提供前期依据。进而为将来铁尾矿营造人工林的树种选择、促进矿区的良性改良和优化发展提供指导。

样地位于河北省迁安市马兰庄镇(39°51′N—40°51 ′N,118°29 ′E—118°56 ′E)，样地是暖温带大陆性季风气候,夏季高温多雨，冬季寒冷少雨，春、秋短促。日温差、年温差大，年降水量少，雨热同期，降水季节分配很不均匀，全年降水的80%集中在夏季6—8月份，期间常有暴雨。河北省迁安市的铁尾矿是由经过多年选矿作业排放出的尾矿堆积而成 。

沙地柏纯林模式2007年在尾矿砂北坡直接栽植沙地柏(Sabina vulgaris Ant.)容器苗4000株，株行距0.5 m×1.0 m，面积30 hm²，形成沙地柏灌木纯林。

紫穗槐纯林模式 2002年、2007年分别在尾矿砂北坡和南坡直播、补播紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)，总计面积30 hm²，形成紫穗槐灌木纯林。

毛白杨纯林模式 2007年在尾矿北坡直播毛白杨(Populus tomentosa)20 hm²。

混交林模式 从2002—2012年陆续在尾矿顶部平地播种五角枫(Acer mono Maxim)、文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge.)、毛白杨(Populus tomentosa)，面积50 hm²。

在公路、铁路两侧尾矿山坡面直接铺设六孔砖固定坡面并修砌排水道，在六孔砖内栽植植物，2008年在尾矿库东坡铺六棱透空水泥砖10万块，面积16 hm²，栽植紫穗槐30万株、沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.) 2.8万株、火炬(Pinus taeda Linn.)3700株、油松(Pinus tabulaeformis Carr.)780棵，侧柏(Platycladus orientalis )960 株、刺槐(Robinia pseudoacacia Linn.)3.8万株，该模式简称为六孔砖。

将尾矿库削坡整地成台阶地形，台阶顶部平铺一层片麻岩风化物和普通土壤的混合物，厚度1—1.5 m，然后推土机推成平地复垦为农田，其坡面栽植豆科植物紫穗槐(Amorpha fruticosa L.)护坡复绿为林地。紫穗槐于2009年4月栽植，埋深40—50 cm，株距10 cm，行距1.5 m，斜坡面积27 hm²，该模式简称为造地紫穗槐林。

以上模式统计见表 1。

2012年7月23—31日在河北省迁安市马兰庄镇铁尾矿区不同树种的植被恢复模式下采集土样，共计9个采样地点，采样地由沙地柏(Sabina vulgaris Ant.)、毛白杨(Populus tomentosa)、紫穗槐(Amorpha fruticosa L.)、油松(Pinus tabulaeformis Carr. )、五角枫(Acer mono Maxim)等植物组成。供试土样在样地距植物50 cm的地方按照五点法分层随机采样5处，取样深度分别为0—10、10—20、20—40、40—60 cm，风干混合5处土样过2 mm筛，装入自封袋中贴好标签带回实验室。

瓦克斯曼77号培养基(分离培养)^[10]：葡萄糖 10 g、磷酸二氢钾 0.5 g、MgSO₄ · 7H₂O 0.2 g、1%MnSO₄ · 4H₂O溶液2滴、1%FeCl₃溶液 2滴、琼脂 20 g、蒸馏水1000 mL、pH值 7.0—7.2。

富集培养基^[11]：葡萄糖10 g、K₂HPO₄ · 3H₂O 0.5 g、NaCl 0.2 g、CaCO₃ 1 g、MgSO₄ · 7H₂ O 0.2 g、酵母膏0.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、pH值7.0—7.2。

将上述土样各称取1 g，加到装有9 mL无菌水并带有灭过菌转子的三角瓶中，置于磁力搅拌器上震荡使其混合(10 min)。将上述土壤悬液作梯度稀释^[12]，稀释度为10^-2 、10^-3、10^-4，每一浓度设置3个重复，用移液枪吸取不同浓度稀释液各0.5 mL放入3个平板中。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，标记好后用封口膜封好，在28 ℃条件下倒置培养3—5 d。选取长势良好的菌株，用接种环挑取不同种类的单菌落，划线分纯数次，筛选到的优势菌株利用甘油冷冻保藏法保存菌株^[13]。

挑取长势良好的菌株接种到50 mL装有20 mL无氮液体培养基的三角瓶中，菌液含菌量为2×10⁶ cfu/ mL,30 ℃、120 r/min培养3 d。以上每个步骤均设3个重复和1个空白对照。

固氮菌的活性测定主要采用乙炔还原法。取5 mL菌悬液盛在10 mL的血清小瓶中，置于摇床上，以180 r/min的转速在28 ℃下振荡培养48 h^[14]。

将血清小瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,并用无菌注射器抽出10%的气体，然后给每瓶注入1 mL C₂H₂，使注入乙炔气体使终浓度为10%，继续培养72 h，对照为加入等量高纯乙炔(使终浓度同样为10%)但未加菌液的血清小瓶。取100 μL反应气体注入气相色谱仪(Trace GC2000,Chrom-cord,Italy)进样柱中，计算C₂H₂、C₂H₄的峰面积^{[15, 16]}。

从气相色谱仪显示屏的C₂H₂、C₂H₄峰值判断有无C₂H₄的产生并确定其固氮性能，根据以下公式计算固氮酶活性的大小，对固氮酶活性高的菌株进行筛选、保存。

乙炔还原活性(ARA)计算公式^{[17, 18, 19]}:

用5 mL菌悬液加入3 mL 0.5 mol/L的NaOH煮沸5 min，加入3 mL 0.5 mol/L的HCl，离心取上清1.0 mL加入5 mL考马斯亮蓝，混合、显色3 min，测定595 nm处吸光值A₅₉₅。根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量^{[20, 21]}。

由固氮酶活性与菌体蛋白含量计算菌株菌体比活力(nmol · mg^-1 · h^-1)^[22]:

观察培养于富集培养基上各菌株在28—30 ℃、培养24—48 h后菌落的颜色、大小、形状、质地、生长速度等。

本实验采用Biolog微生物鉴定系统进行初步鉴定，其由浊读仪、读数仪、软件、数据库、微孔鉴定板组成，与计算机联网。对结果的鉴定需要考虑可能性、相似性、位距3个参数；通过 SIM、DIST和PROB值与数据库中的ID比较，确定被鉴定的微生物的属种^[23] 。

首先按照表型鉴定常规方法^[24]对获得的菌株进行革兰氏染色、氧化酶实验以及三糖铁实验，确定菌株类型。然后按照Biolog微生物的鉴定流程，选择与菌株类型相对应类型的鉴定板以及培养条件。Biolog鉴定方法:将获得的菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基连续培养3—4代，选择培养生长良好的单菌落,转接到BUG+B固体培养基上，于30 ℃培养24 h，用无菌竹签挑取少量新鲜菌落,将专用接种液制备为均一菌悬液，与标准菌悬液进行浊度对比,误差控制在±2%。用八通道移液器将菌悬液接种到Biolog GN板，每孔接种菌液150 μL。将接种好的鉴定板编号并置于30 ℃培养，在培养4—6 h和16—24 h时用读数仪读取菌株的特征性碳源代谢指纹特征，结果与Biolog数据库的菌株进行比对分析，确定分离菌株。

利用瓦克斯曼77号培养基进行初步固氮菌筛选，按照调查样地编号，初步统计了不同植被恢复模式下样地不同深度土壤层中固氮菌的个数(表 2)。

由表 2可明显的反映出几个特点：①总体上来讲C号样地比A、F、G、H号样地的固氮菌个数多，即从铁尾矿堆阳坡(南坡)筛得的固氮菌菌株数比阴坡(北坡)的多；②总体上H号样地比F号样地固氮菌个数多，即种植年限长的植被固氮菌株数比年限短的多；③总体上B号样地要比其它样地固氮菌个数多，即使用六孔砖等措施的样地的菌株数要比没使用特殊改良措施的样地菌株数多。④总体上D号样地要比其它样地固氮菌个数多，即混交林模式比其他纯林模式的固氮菌多。另外，在10—40 cm这个土壤层次中固氮菌更易于生长和繁殖。

采用瓦克斯曼77号培养基筛选铁尾矿不同树种栽植模式下、不同土壤层次下的固氮菌，在48 h后即可观察到生长情况，大多数分离出的菌落呈透明、半透明状或乳白色、圆形、形状较小、边缘整齐、表面光滑、突起、少数为黄褐色。培养基上的部分菌株的菌落特征(图 1)。根据长势从中选取出48株生长状态较好的固氮菌，进一步进行固氮酶活性分析。

根据菌落生长状态等生物学水平标准^{[25, 26, 27]}，初步筛选出48株固氮菌，测定ARA值，结果(图 2)。

图 1 筛选培养基部分菌株的菌落特征 Fig. 1 The colony character of some strains in selective medium

图选项

图 2 自生固氮菌固氮酶活性的测定 不同样地分别用A到I表示，土壤层0—60cm分别用a到d表示，同一样地相同层次的筛出的不同菌株用数字1、2、3、4区分; 大写字母表示P<0. 01显著水平,小写字母表示P<0. 05显著水平,同列中标注相同字母的值之间差异不显著 Fig. 2 measurement of the activity of free-living nitrogen fixing bacteria

图选项

筛选其中ARA＞0.9的菌株，利用考马斯亮蓝法测定菌体蛋白含量(图 3)。

根据公式计算单位蛋白固氮酶活力，即固氮菌菌体比活力 (图 4)。根据图 4可以看出其中的45株菌活力较低在7.84—69.71 nmol · mg^-1 · h^-1，说明这45株菌不具有固氮能力或固氮能力较低，只有Id1，Db1，Ec1 3株菌不但菌体生长迅速且固氮酶活力较高，可以用于制成微生物菌剂进行铁尾矿土壤改良。

图 3 固氮菌菌体蛋白含量的测定 相关性分析中*表示该菌株与其他任何菌株相比差异性都表现为极显著P < 0.01 Fig. 3 measurement of the level of protein of free-living nitrogen fixing bacteria

图选项

图 4 单位蛋白固氮酶活力 相关性分析不同大写字母表示不同菌株间显著差异P﹤0.05 Fig. 4 Determination of nitrogenase activity unit of protein

图选项

将固氮酶活力高的Ec1在富集培养基上划线分纯得到的单菌落进行鉴定，Biolog系统规定：细菌培养4—6 h其SIM ≥ 0.75，培养 16—24 h SIM ≥ 0.5，系统自动给出鉴定结果为种名，当SIM 值小于0.75(4 —6 h)或0.5(16 —24 h)，但鉴定结果中属名相同的结果的SIM 值之和大于0.75或0.5时，自动给出的鉴定结果为属名，其它情况不给出结果，只给出10个最接近的种名。本次测定的菌株Ec1革兰氏染色为阴性、氧化酶实验为阳性、三糖铁实验为上层底层均不产酸，由于其SIM值小于0.75，初步鉴定出的菌属名为固氮菌属(Azotobacter)，还需进一步利用16S rRNA基因进行准确鉴定。

铁尾矿具有非常严酷的基质条件，如物理性质不良(极端的水湿条件和温度变化等)、贫瘠(有机质、氮含量极低或无)、极端pH值(过酸或过碱)，有些尾矿废弃地还含有高浓度的有害物质(如重金属等)。研究表明固氮菌不仅具有固氮作用，还具有溶磷作用^[28],可以改善土壤成分，为退化生境恢复提供物质基础，植物根系的生长活动与微生物群落的发展具有相互促进作用^[29]。而通常的固氮菌很难在铁尾矿这样的环境中生长并发挥作用，本研究是首次从已经初步现显良好修复效果的铁尾矿的不同植被中筛选高效土著固氮菌，这样的微生物能在铁尾矿恶劣的条件下生存，比一般的固氮菌更适应在铁尾矿不良环境中生存，并且具有较高固氮活力,能为植物提供大量氮素。

蒋宝贵、赵斌^[30]从农场试验田筛选到的一株固氮活力为390 nmol · mg^-1 · h^-1的固氮菌，房春红等^[31]从大豆根瘤中直接分离出的一株固氮活力为290 nmol · mg^-1 · h^-1的固氮菌，吴若菁等^[32]从香椿根中分离出的一株固氮活力为127.26 nmol · mg^-1 · h^-1的内生固氮菌，与此前的研究结果比照，本研究筛选出的两株固氮菌Db1、Ec1固氮活力分别为203.20 nmol ·mg^-1 · h^-1和307.23 nmol · mg^-1 · h^-1，结合尾铁矿生境特征，Db1、Ec1这两株菌的固氮活力已经是相当高的了，但固氮菌作为活性微生物，在不同环境下其固氮能力增殖能力等都有可能发生变化，因此还需制成菌剂进行进一步实验验证。

本研究还表明不同铁尾矿不同树种栽植模式下，固氮菌的菌落个数及固氮活力不同，这与不同树种对铁尾矿的改良作用是息息相关的。固氮菌Ec1是来源于5号样地(2009年造地紫穗槐林)，固氮菌Db1来源于4号样地(毛白杨、五角枫等构成的混交林)，由此可以看出种植豆科植物或物种多样性较高的混交林地更适合微生物生存，植物为微生物繁殖提供良好的场所，微生物增加土壤肥力为植物生长提供营养，二者达成互利互惠的关系。结合在固氮菌的筛选过程中得到的特点，可以推断出：(1) 由于南坡是迎光面且降水多，温度和湿度都要比北坡适宜所以固氮菌菌株数多；(2) 由于种植年限越长，定居的植物越多，物种丰富度越高，对土壤的改良作用越好，越适宜微生物繁殖；(3) 由于特殊的改良措施更利于水土保持、消除对植物定居的限制、增加植被覆盖率，同样也为微生物的生长繁殖创造了良好的条件；(4) 由于混交林较之单纯林，林内光照减弱，温度低，湿度大，风速小，枯落物较多，根系深广，地上地下部分结构比单纯林复杂，在涵养水源、保持水土、防风固沙，以及其他防护效益方面都优于单纯林，为固氮微生物的生长提供良好的场所。

近年来我国可开采的铁矿石品位低、共伴生的泥矿多，铁尾矿已然成为我国排放量最大、综合利用率最低的固体废弃物。铁尾矿性质复杂，回收和利用难度大，由于这些特性已使其成为当前我国工业固体废物的主要组成部分，因此当务之急是要对铁尾矿废弃地进行植被恢复和生态重建。生物固氮与直接施用化学氮肥相比，具有不污染生态环境、不耗费额外能源、生产成本低等特点，从铁尾矿中筛选到的土著固氮菌在铁尾矿生态系统的恢复中将具有巨大的应用前景,引入高效功能微生物可以改善退化生态区域的土壤，有助于科学有效地改良尾矿砂土壤微生态环境，为铁尾矿人工林的营造、促进矿区的良性改良和优化发展及增强提供指导。关于固氮菌在与植物结合后的具体促生作用及其实际的对植株的固氮贡献，有待进一步研究。