近年来，我国设施栽培面积迅速增加，由于设施土壤季节性或常年被覆盖，土壤得不到雨水淋洗，设施内温度高，土壤水分蒸发强烈，再加上化肥的过量施用，造成盐分在表层土壤积聚，引起土壤次生盐渍化^{[1, 2]}。设施土壤次生盐渍化区别于盐土(以NaCl为主)和盐碱土(以NaCl和NaHCO₃或Na₂CO₃为主)的最大特点是以Ca²⁺和NO^-₃等积累为主。研究表明，造成设施土壤次生盐渍化的主要阴离子有NO^-₃、Cl^-、SO^2-₄和HCO^-₃，阳离子有Ca²⁺、Na⁺、K⁺和Mg²⁺，在这些离子中，最多的是Ca²⁺和NO^-₃，其中Ca²⁺占所有阳离子的60%，NO^-₃占所有阴离子的67%—76%^[3]。尽管Ca²⁺和NO^-₃作为植物吸收钙元素和氮元素的主要形式，在植物生长发育中发挥重要的生理功能，但设施土壤中过多的Ca(NO₃)₂积累也会导致植株产生严重的氧化胁迫和代谢紊乱，从而导致黄瓜^{[4, 5]}、番茄^[6]等作物产量降低、品质下降。许多研究结果都证明，Ca(NO₃)₂大量积累已经成为我国设施土壤次生盐渍化的主要盐类^[7]。

鉴于Ca(NO₃)₂对植物生长发育的特殊作用，植物对其胁迫的应答机制与NaCl胁迫必然有所不同，而国内外关于植物盐胁迫生理的研究大多都集中于NaCl胁迫，不能准确反映设施土壤次生盐渍化对作物的伤害机理。因此，开展作物对不同盐类胁迫响应差异的研究，对阐明设施土壤盐渍化对作物的伤害机理及寻求有效的克服途径和方法具有重要意义。前人也开展了等渗NaCl和Ca(NO₃)₂胁迫对黄瓜^[8]、南瓜^[9]、番茄^[10]等作物生长和生理特性的影响，认为等渗的NaCl胁迫对作物的伤害大于等渗Ca(NO₃)₂胁迫，然而这些研究均未能解释造成这种差异的生理机制。

黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种世界性的重要蔬菜作物，也是我国设施栽培中面积较大、种植范围较广的主要蔬菜作物之一，但其根系具有脆弱、好气、分布较浅的特点，对盐渍环境适应性较差，设施土壤盐分积累容易引发黄瓜植株的生理性病害，严重影响产量和品质。为此，本试验以盐敏感型的黄瓜品种‘津春2号’为材料，从生长、光合特性、活性氧代谢、阳离子吸收等方面，研究等渗NaCl和Ca(NO₃)₂胁迫对黄瓜幼苗生长和生理特性的影响，探讨黄瓜幼苗对不同盐类胁迫的生理响应差异，为寻求有效克服设施土壤盐渍化的途径和方法提供理论依据。

试验选用盐敏感型的黄瓜品种‘津春2号’^[8]为试材，种子由天津黄瓜研究所提供；选用的营养液配方为日本山崎黄瓜专用配方(表 1)。

试验于2011年9月—2012年12月在南京农业大学牌楼试验基地的现代化玻璃温室中进行。黄瓜种子经浸种催芽后，播种于石英砂中育苗。待幼苗2叶1心时定植于盛有1个剂量日本山崎黄瓜专用配方的营养液栽培箱(18 cm× 48 cm× 24 cm；20 L)内，幼苗预培养3 d后一次性加盐处理，使营养液中NaCl和Ca(NO₃)₂的终浓度分别达到75 mmol/L和50 mmol/L(根据预备试验，该浓度下两种盐处理的黄瓜幼苗生物量差异最大，数据略)，用FM-8P全自动冰点渗透压计测得加盐后营养液的初始渗透势均为-46.3 MPa。试验设3个处理，分别为：对照(CK，正常营养液栽培)，75 mmol/L NaCl处理(NaCl)，50 mmol/L Ca(NO₃)₂处理(Ca(NO₃)₂)，每处理重复3次，随机区组排列，每个区组内各处理均3箱，每箱定植黄瓜幼苗12株。试验期间，温室内温度保持在13—28 ℃，相对湿度(RH)60%—75%，光合有效辐射(PAR)为400—800 μmol · m^-2 · s^-1。盐胁迫处理5 d后，每重复取样9株幼苗(每箱取样3株)进行生长指标和生理指标测定；光合气体交换参数和叶绿素荧光参数测定时，每重复取样3株(每箱取样1株)进行测定，取其平均值。叶片生理指标和光合、荧光参数测定时的取样部位为幼苗生长点之下第2和(或)第3片真叶。

用去离子水将黄瓜幼苗冲洗干净并吸干水分，从根茎结合处剪断，分为地上部和地下部，称得鲜重(g/株)；在烘箱中105 ℃下杀青15 min后，然后在75 ℃的恒温下烘干至恒重，称得干重(g/株)。

按沈伟其^[11]的方法分别测定A645、A663处的吸光值，并计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和总叶绿素(Chl(a+b))含量。

超氧阴离子自由基(O^{- ·}₂ )产生速率按照王爱国和罗广华^[12]的羟胺反应法测定，以nmol · g^-1鲜重 · min^-1表示；过氧化氢(H₂O₂)含量的测定参照Uchida等^[13]的方法，以μmol/g 鲜重表示；MDA含量的测定按照Heath和Packer^[14]的方法，以nmol/g 鲜重表示。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照氮蓝四唑(NBT)光还原法^[15]，过氧化物酶(POD)活性测定参照 Kochba等^[16]的方法，过氧化氢酶(CAT)活性测定参照 Dhindsa 等^[15]的方法。

将新鲜样品洗净后用吸水纸吸干水分，分别剪取根系、茎和不带叶柄的叶片，在105 ℃下杀青15 min后在70—80 ℃下烘干至恒重，磨碎后过30目筛，取50 mg样加20 mL蒸馏水摇匀，在100 ℃沸水浴中煮1.5—3 h，冷却后定容至100 mL。黄瓜幼苗各器官中K⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的含量分别在OD 766.49、589.59、285.21、317.93 nm下利用原子吸收分光光度计(日立Z-2000)测定。

采用便携式光合测定系统(Li-6400，美国LI-COR公司)于晴天9：00—11：00 进行光合参数测定。测定时叶室温度控制在(25 ± 1) ℃，光强控制在800 μmol · m^-2 · s^-1，参比室CO₂浓度为(380 ± 10) μmol/L，相对湿度(RH)为60%—70%。选取叶位一致、完全展开的功能叶测量其净光合速率(P_n，μmol CO₂ · m^-2 · s^-1)、气孔导度(G_s，mol · m^-2 · s^-1)、胞间CO₂浓度(Ci，μmol CO₂/mol)，并计算气孔限制值^[17](L_s，%)：L_s=1-C_i/C_a，式中C_a为空气中CO₂浓度(μmol/mol)。

选取与光合气体交换参数测定时相同的叶位用PAM 2100调制荧光仪(德国Walz公司)进行测定。叶片经过30 min充分暗适应，照射测量光，得到原初荧光F_o，随后打开饱和脉冲光800 0 μmol · m^-2 · s^-1，0.8 s后关闭，得到暗适应最大荧光F_m。打开作用光，待叶片光合作用达到稳态后得到光合稳态荧光F_s并记录，打开饱和脉冲光800 0 μmol · m^-2 · s^-1，0.8 s得到光化学作用下最大荧光F′_m，然后关闭作用光，立即打开远红光，约6 s后关闭，得到光适应叶片的最小荧光F′_o。计算暗条件下最大光化学效率(F_v/F_m)、光系统Ⅱ(PSⅡ)实际光化学效率(Ф_PSⅡ)、光条件下最大光化学效率(F′_v /F′_m)、光化学淬灭系数(qP)、PSⅡ的潜在活性(F_v/F_o)和非光化学淬灭系数(qN)。光化学反应的能量部分(P)、天线耗散能量(D)、PSⅡ反应中心的过剩光能(E_x)的份额分别按下式计算^[18]：P =(F_m′-F_s)/F_m′；D=l-F_v′/F_m′；E_x=F_v′/F_m′×(1-qP)。

数据分析采用MS Excel 2003软件制作图表，SAS9.0软件进行数据单因素方差分析，数据显著性差异运用Duncan′ s新复极差法进行多重比较(P﹤0.05)。

如表 2所示，NaCl和Ca(NO₃)₂处理显著抑制了黄瓜幼苗生长，总鲜重和总干重均显著低于对照，其中NaCl处理对黄瓜幼苗生长的抑制作用大于Ca(NO₃)₂处理。NaCl胁迫下，黄瓜幼苗根系和地上部的鲜重、干重均显著低于对照；Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗地上部生长显著受到抑制，而对根系生长的影响不明显。可见，Ca(NO₃)₂胁迫主要抑制黄瓜幼苗地上部生长，而NaCl胁迫可使黄瓜幼苗根系和地上部的生长均受到抑制。

如表 3所示，等渗NaCl和Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗叶片Chl a、Chl b、Chl(a+b)含量和Chl a/ Chl b均显著下降，但Ca(NO₃)₂胁迫下黄瓜幼苗叶片Chl a/ Chl b显著高于NaCl胁迫。

如图 1所示，等渗NaCl和Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗叶片P_n、G_s、C_i均显著低于对照，而L_s显著高于对照，但NaCl胁迫引起的升高或降低幅度均大于Ca(NO₃)₂胁迫。按照Farquhar等^[19]的判断标准，NaCl与Ca(NO₃)₂胁迫引起黄瓜幼苗叶片光合速率降低主要是由气孔因素引起。

图 1 等渗Ca(NO3)2和NaCl胁迫对黄瓜幼苗叶片光合气体交换参数的影响 Fig.1 Effects of iso-osmotic Ca(NO3)2 and NaCl on photosynthetic gas exchange parameters of cucumber seedling leaves CK：正常营养液栽培Control；NaCl：NaCl胁迫处理NaCl stress；Ca(NO3)2：Ca(NO3)2胁迫处理Ca(NO3)2 stress；不同小写字母表示差异显著(P﹤0.05)

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如图 2所示，NaCl胁迫显著降低黄瓜幼苗叶片的F_v/F_m、F′_v /F′_m、F_v/F_o、Ф_PSⅡ和qP值，显著提高qN值；Ca(NO₃)₂胁迫显著降低了黄瓜幼苗叶片的F_v/F_m和F_v/F_o值，但对F′_v/F′_m、Ф_PSⅡ、qP和qN值无显著影响。

图 2 等渗Ca(NO3)2和NaCl胁迫对黄瓜幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响 Fig.2 Effects of iso-osmotic Ca(NO3)2 and NaCl on fluorescence parameters of cucumber seedling leaves

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利用叶绿素荧光参数将植物叶片吸收的光能分为3部分，D、E_x和P。通过测算植物叶片的P、D、E_x的份额，可以了解植物的光能分配情况^[18]。图 3表明，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗叶片的P显著降低，而E_x显著升高16.89%，对D无明显影响；Ca(NO₃)₂胁迫对P和D无明显影响，但使E_x显著升高6.95%。

图 3 等渗Ca(NO3)2和NaCl胁迫对黄瓜幼苗叶片PSⅡ光化学反应能量部分(P)、天线耗散能量部分(D)和PSⅡ反应中心过剩光能(Ex)分配的影响 Fig.3 Effects of iso-osmotic Ca(NO3)2 and NaCl on allocation of photochemistry energy (P) 、dissipation energy (D) by antenna and excessive energy in PSⅡ (Ex) of cucumber seedling leaves

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由图 4所示，NaCl胁迫显著提高了黄瓜幼苗叶片的O^{- ·}₂ 产生速率、H₂O₂和MDA 含量，Ca(NO₃)₂胁迫也显著提高了黄瓜幼苗叶片的O^{- ·}₂ 产生速率和H₂O₂含量，但对MDA 含量无显著影响。

图 4 等渗Ca(NO3)2和NaCl胁迫对黄瓜幼苗叶片O-2产生速率、H2O2含量和MDA 含量的影响 Fig.4 Effects of iso-osmotic Ca(NO3)2 and NaCl on O-2 production rate,H2O2 and MDA content in cucumber seedling leaves

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图 5所示，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗叶片SOD 活性显著低于对照，而POD 和CAT 活性则高于对照；Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗叶片SOD、POD 和CAT 活性均显著高于对照和NaCl胁迫处理。

图 5 等渗NaCl和Ca(NO3)2胁迫对黄瓜幼苗叶片SOD、POD、CAT活性的影响 Fig.5 Effects of iso-osmotic Ca(NO3)2 and NaCl stress on SOD,POD and CAT activities in leaves of cucumber seedlings

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由表 4可以看出，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗各器官中的Na⁺含量显著升高，K⁺含量显著下降，而Ca²⁺和Mg²⁺含量在各器官中的变化不一致；Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗各器官中的Na⁺含量变化不明显，而使Ca²⁺含量均显著升高，K⁺和Mg²⁺含量均有所降低。为了更准确反应胁迫条件下离子吸收状况，分析了胁迫条件对离子吸收比率的影响，结果表明，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗根、茎、叶的K/Na、Mg/Na、Ca/Na比值均显著降低；Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗根、茎、叶的Ca/Na比值显著升高(表 5)，而根、茎、叶的K/Ca、Mg/Ca均显著降低(表 6)。

盐胁迫下，由于植株碳同化量减少、渗透调节能耗和维持生长能耗增加等原因，一般会使植株生长 量和积累量减少^[20]。本试验结果表明，75 mmol/LNaCl 和50 mmol/L Ca(NO₃)₂处理均显著抑制了黄瓜幼苗生长(表 2)，这与童辉等^[8]的研究结果一致。本实验中，Ca(NO₃)₂胁迫抑制黄瓜幼苗生长主要是抑制其地上部分的生长，而对根系生物量积累的影响不大(表 2)。之前的研究发现，Ca(NO₃)₂胁迫显著影响了黄瓜幼苗根系的形态，使其根系伸长受到抑制，但侧根急剧缩短，分枝增多，导致侧根密度显著增大，根尖数增多，且根系平均直径变大^[21]，这可能是Ca(NO₃)₂胁迫对黄瓜幼苗根系生物量积累无显著影响的主要原因。

光合作用是植物生长发育的基础。盐胁迫下，由于渗透平衡被破坏，根系低水势引起植物叶片失水，气孔关闭或开度减小，CO₂供应不足，导致植物光合速率下降^{[22, 19]}。本试验也得到了类似的结果(图 1)。目前认为，盐胁迫导致光合作用效率下降的主要原因有以下两个因素：① 气孔关闭，导致胞间CO₂浓度下降，用于光合作用的原料减少，即气孔因素；② 非气孔因素^[23]，如CO₂同化能力降低、光合电子传递受阻、光合膜蛋白的减少^[24]、能量消耗增多、光合色素含量减少^[25]等。然而，限制光合作用的气孔因素、非气孔因素二者之间并不是相互独立的^[26]，在气孔因素发挥主导作用的同时，非气孔因素同样在发挥作用。为了更好地理解NaCl与Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗叶片P_n降低的非气孔限制，分析了二种盐胁迫下黄瓜幼苗的叶绿素荧光参数，发现F_v/F_m和F_v/F_o均显著降低(图 2)，说明PSⅡ原初光能转化效率和PSⅡ的潜在活性降低，PSⅡ受到了损伤^[27]。但是，在NaCl胁迫下，F′_v /F′_m和Ф_PSⅡ显著降低(图 2)，说明PSⅡ反应中心原初光能捕获效率和实际原初光能捕获效率均降低，特别是Ф_PSⅡ的降低阻止了植株同化力(NADPH、ATP)的形成，同时qP显著降低，光合电子传递受到抑制^[28]，从而影响了植株对碳的固定和同化；而Ca(NO₃)₂胁迫对F′_v /F′_m、Ф_PSⅡ和qP无明显影响(图 2)，表明CO₂固定和同化没有受到影响。至此，可以认为，NaCl胁迫导致黄瓜幼苗光合速率降低，是由于在气孔导度降低而造成CO₂扩散至叶肉细胞受到限制的同时，碳同化能力也降低；而Ca(NO₃)₂胁迫导致黄瓜幼苗P_n降低，主要是因为气孔因素造成的CO₂供应减少所致。当然，NaCl胁迫下黄瓜幼苗qN显著升高，不难理解为捕获的光能不能完全通过光合电子传递给PSⅡ反应中心时，为了避免过剩光能对光合器官的损伤，通过非光化学的形式予以耗散。

当植物叶片吸收的光能除了用于光化学反应、热耗散和荧光发射外仍有过剩时，短期内植物发生光抑制，净光合速率降低^[29]；长期则使过剩光能激发Chl分子变为三线态叶绿素分子(³Chl^*)，³Chl^{* ·} 释放电子与O₂结合形成破坏性更强的自由基如O^{- ·}₂、H₂O₂、羟自由基(OH ^·)等，进而破坏膜系统和Chl分子^[30]，导致膜质过氧化。本实验结果表明，NaCl胁迫引起黄瓜幼苗叶片用于光化学反应的能量部分P显著降低(图 3)，促使PSⅡ反应中心过剩能量E_x显著升高，而这些过剩光能不能通过热耗散等途径有效耗散(D无明显变化)，从而激发形成了大量O^{- ·}₂、H₂O₂等ROS，加重了膜质过氧化伤害程度(图 4)，并导致总叶绿素尤其是Chl a显著降低(表 3)；而Ca(NO₃)₂胁迫对P和D无明显影响，从而使E_x升高幅度有限(升高6.95%)，激发形成的ROS伤害程度较小。

正常情况下，植物体内存在ROS清除系统，使植物在生命活动中产生的ROS处于产生和消除的动态平衡，从而使植物免受ROS伤害。其中，SOD与CAT、POD以及B₂胡萝卜素等抗氧化剂协同作用，可防御ROS等自由基对细胞膜系统的伤害。当植物处于盐胁迫等逆境时，ROS动态平衡被打破，产生大量ROS，造成植物体产生严重的膜质过氧化伤害，并导致光合色素含量降低，影响植株的光合性能^[31]。本实验结果表明，Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗叶片SOD、POD和CAT活性均显著升高(图 5)，ROS清除能力增强，并未对黄瓜幼苗植株造成严重的膜质过氧化伤害；而NaCl胁迫下，尽管POD和CAT活性显著升高，但升高幅度不大，再加上SOD活性显著降低(图 5)，对ROS清除能力有限，导致ROS积累(图 4)，引起了膜质过氧化产物MDA积累(图 4)和Chl含量降低(表 3)。

盐胁迫对作物造成的危害主要有离子毒害、渗透胁迫和营养失衡^[32]，这些危害均与作物对盐分离子的吸收累积有着直接和间接的关系^[33]，而维持细胞内离子动态平衡是植物在盐胁迫下生存的基础^[34]。本实验结果表明，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗各器官中的Na⁺含量显著升高(表 4)，根、茎、叶中的K/Na、Mg/Na、Ca/Na比值均显著降低(表 5)，离子平衡被打破，Na⁺与K⁺、Ca²⁺等各种营养元素相互竞争而造成植株矿质营养胁迫，严重影响黄瓜幼苗植物正常生长。Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗各器官中的Ca²⁺含量显著升高，而K⁺和Mg²⁺含量均有所降低(表 4)，致使K/Ca、Mg/Ca比值显著降低(表 5)，离子平衡同样被打破。尽管Ca²⁺在植物生长发育中起着重要的作用，作为第二信使参与植物体内的许多生理过程^[35]，如激活NAD激酶、膜结合蛋白激酶及Ca²⁺-ATP酶(Ca²⁺-ATPase)等许多酶的活性，还可通过调节保卫细胞内膨压的变化影响气孔的开放^[36]，但是，高钙胁迫则会造成细胞骨架和生物膜结构的破坏，并最终导致细胞内物质代谢的紊乱等^[37]。尽管如此，植物细胞积累过多的Na⁺要比积累过多的Ca²⁺对植物体的伤害作用要大，这是因为Na⁺在细胞中大量积累，不仅会改变细胞膜系统的结构和功能，而且会导致光合作用中具有重要作用的酶活性降低。如在NaCl胁迫下，玉米幼苗的苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)以及RuBP羧化酶的活性都显著降低^[38]。这就不难解释在本实验中，NaCl胁迫下黄瓜幼苗植株碳同化能力降低的原因，而Ca(NO₃)₂胁迫对碳同化的影响不大。

综上所述，黄瓜幼苗对等渗NaCl 和Ca(NO₃)₂胁迫的生理响应存在差异。NaCl胁迫下黄瓜幼苗体内Na⁺大量积累，不仅限制了环境中CO₂进入叶肉细胞，而且使碳同化能力降低，加之ROS清除能力有限，不能有效清除PSⅡ反应中心过剩能量所导致的ROS，因而产生了严重的膜质过氧化，影响了植株生长和光合速率；而Ca(NO₃)₂胁迫下，黄瓜幼苗碳同化能力没有受到影响，ROS也能够被抗氧化系统有效清除，植株没有产生严重的膜质过氧化，因而对生长和光合速率的影响没有NaCl胁迫大。