苹果是我国栽培面积最大的果树树种，受土地资源限制，老果园更新时面临连作障碍现象较为普遍，即病虫害严重、产量下降、品质变劣等，给果农造成巨大的经济损失。如何有效缓解或克服连作障碍已成为苹果产业可持续发展的一项重要工作^{[1, 2]}。

苹果连作障碍由来已久，病因复杂。在多数地区，与土传真菌有关的生物因素是造成连作障碍的主要原因^{[3, 4, 5]}。Urashima等^[6]研究发现芦荟连作障碍与真菌群落结构的变化有关。李延茂等^[7]研究结果显示，杉木连作引起土壤真菌种群发生较大变化。李坤等^[8]采用PCR-DGGE技术，对连作的葡萄种植园进行研究表明，葡萄连作对土壤细菌与真菌的群落组成产生了显著的影响。因此，探究苹果连作对土壤真菌群落多样性及群落结构的影响，特别是不同连作果园真菌群落结构特征，对于进一步了解和防控苹果连作障碍具有重要意义。

末端限制性片段长度多态性( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)技术是研究微生物多样性的一种新兴的分子生物学方法^{[9, 10]}，不依赖于培养即可进行群落分析^[11]。这种技术可有效地用于微生物菌种鉴定、群落的对比和多样性分析^[12]。本文将T-RFLP技术用于连作苹果园土壤真菌群落结构的研究中，基于T-RFLP图谱，运用多样性指数、聚类分析和主成分分析比较了不同连作苹果园不同取样位置、不同土层的土壤真菌多样性及其群落结构特征，以期掌握连作苹果园土壤真菌分布状况及群落结构特征变化，为防控苹果连作障碍提供一定的理论基础。

2012年3月分别在山东省泰安市宁阳县磁窑镇大磨庄村、岱岳区道朗镇玄庄村和烟台莱州市金城镇大沙岭村选取一片20年生的老果园，去除老树后，重新栽植两年生富士/平邑甜茶苹果幼苗，新建三片连作园。不同园片按原树穴、原行间和原株间三处分别采样，采样在幼树周围半径0.5 m范围内进行，挖直径40 cm，深60 cm的土坑，分0—30 cm和30—60 cm采集土样，将土样过筛、装入封口袋，避光储存，带回室内分析，3次重复。

参照鲍士旦《土壤农化分析》第三版^[13]的方法，对土壤氮磷钾和有机质进行测定。速效磷(P₂O₅)-钼锑抗比色法；速效钾(K₂O)-火焰光度法；有机质的测定-重铬酸钾容量法(稀释热法)；铵态氮和硝态氮 (NH-H和NO-N)-CaCl₂浸提流动注射分析仪法^[14]。

样品基因组总DNA的提取及纯化按照E.Z.N.A. Soil DNA Kit说明书进行操作。

用于ITS 片段扩增的引物采用带FAM荧光标记的真菌通用引物ITS1-F-FAM和ITS4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

ITS1-F-FAM(5′→3′): CTTGGTCATTTAGAG GAAGTAA；

ITS4(5′→3′): TCCTCCGCTTATTGATAGC

ITS 扩增反应体系为：12.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL DNA 模板，ITS1-F 和ITS4(10 μmol/L)各1.5 μL，加ddH2O 至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环；最后72 ℃延伸10min。取5 μL ITS-PCR 扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，按照PCR产物纯化试剂盒说明书进行PCR产物纯化，-20 ℃保存备用。

用限制性内切酶Hha I对上述PCR纯化产物进行酶切。酶切反应体系为30 μL： 含10 μL ITS-PCR 纯化产物、2 μL Hha I (10 U/μL)、2 μL 10×Buffer、加ddH2O 至30 μL。置于37 ℃水浴中温育4 h,酶切完毕后65 ℃水浴20 min 终止反应。将酶切产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序。

用 Peak Scanner软件分析各样品的T-RFLP图谱，去掉引物峰及杂峰，其中T-RF小于50 bp为引物峰，相对峰面积(每个限制性片段的峰面积除以累计峰面积)小于0.5%为杂峰^{[15, 16]}。单个T-RF(Terminal Restriction Fragment) 的相对峰面积( Ap) 按照公式Ap=ni /N×100计算，式中ni 代表每个可分辨的T-RF 的峰面积，N 代表所有T-RF 峰面积的总和^[17]。以图谱中每一个可统计的T-RF，视为一个OTU(Operational Taxonomic Unit)。根据图谱中OTU 的数目及其丰度通过BIO-DAP程序(http://nhsbig.inhs.uiuc.edu/wes/populations.html)计算样品的多样性指数 (H)、优势度指数(D)、丰富度指数 (SR) 和均匀度指数 (E)^{[18, 19]}。 同时，计算18个样品两两之间的Sorenson相似指数:Cs=2N_AB/(N_A+N_B)，式中N_AB指A、B两个样品共有的条带数目(相差士l bp内算同一条带)，N_A、N_B指A、B两样品各自的条带数。

根据T-RFs在不同样品图谱中的分布及丰度，采用SPSS软件对18个样品进行主成分分析(PCA)和聚类分析。

由表 1数据可以看出，磁窑、道朗和金城连作园的土壤样品间理化指标差异显著，各采样地行间、树穴和株间处理间的土壤样品间理化指标差异显著，且0—30 cm和30—60 cm土层的理化指标也差异显著(P≤0.05)。除个别样品外，0—30 cm土层的铵态氮(NH-N)、硝态氮(NO-N)、速效磷(P)、速效钾(K)和有机质(TOC)的含量要高于30—60 cm土层，且达显著性差异；金城连作园各处理的硝态氮、速效磷、速效钾和有机质含量均高于磁窑、道朗连作园，且达显著性差异；而磁窑和金城连作园0—30 cm土层各处理的铵态氮含量均高于道朗连作园，且达显著性差异，在30—60 cm土层各处理的铵态氮含量道朗、金城连作园均高于磁窑连作园。

限制性内切酶的种类是影响T-RFLP 结果的关键因素^[20]。不同限制性内切酶的酶切所获T-RFs 数量不同,段魏魏^[21]等研究发现酶HhaⅠ相对于Hae Ⅲ更适合分析真菌的群落多样性，本实验利用限制性内切酶HhaⅠ对磁窑、道朗和金城连作园样品的土壤真菌ITS 区进行酶切，T-RFLP 分析结果见图 1。从图 1 可以看出，酶切谱带清晰，T-RFs 比较明显，酶切片段在50—600 bp 之间，不同样品间真菌群落存在明显差异。

图1 磁窑、道朗和金城连作园土壤样品总DNA Fig. 1 Total DNA of apple replanted ochard soil of Ciyao,Daolang and Jincheng 1： 磁窑行间0—30 cm; 2： 磁窑树穴0—30 cm; 3： 磁窑行间30—60 cm; 4： 磁窑株间30—60 cm; 5： 磁窑树穴30—60 cm; 6： 磁窑株间0—30 cm; 7： 道朗行间0—30 cm; 8： 道朗树穴0—30 cm; 9： 道朗株间0—30 cm; 10： 道朗行间30—60 cm; 11： 道朗树穴30—60 cm; 12： 道朗株间 30—60 cm; 13： 金城行间0—30 cm; 14： 金城树穴0—30 cm; 15： 金城株间0—30 cm; 16： 金城行间30—60 cm; 17： 金城树穴30—60 cm; 18: 金城株间30—60 cm

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图2 连作果园的土壤样品的T-RFLP图谱 Fig. 2 T-RFLP profiles of soil samples in apple replanted ochard

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根据T-RFLP图谱中OTU的数量、种类及丰度，分别计算了3个地区18个土壤样品的真菌多样性指数(表 2)。在0—30 cm土层，金城连作园树穴处理具有最高的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和最低的优势度指数；磁窑、道朗连作园的树穴处理也具有较高的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和较低的优势度指数。在30—60 cm土层，磁窑连作园的行间、树穴和株间处理均具有最低的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和最高的优势度指数，而除金城行间外，道朗、金城连作园的行间、树穴和株间处理均具有较高的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和较低的优势度指数。总体来说，除道朗株间处理外，0—30 cm土层的土壤真菌的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数均高于30—60 cm土层，优势度指数的趋势正好相反。

根据18个样品间相同的T-RFs计算出相似系数(表 3)，根据T-RFs及其相对峰面积对各样品进行了聚类分析(图 3)。

图3 不同样品间T-RFLP图谱的聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of T-RFLP patterns of different samples

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根据Jaccard^[22]相似性系数原理，当Cs值为0.00—0.25时，为极不相似；当Cs值为0.25—0.75时，为中等相似；当Cs值为0.75—1.00时，为极相似。由各样品间的相似系数和聚类分析可知，磁窑连作园各样品之间土壤真菌相似性系数很高，在0.522—0.800之间，根据Jaccard 相似性原理，处于极相似与中等相似之间，以4号(磁窑株间30—60 cm)与5号(磁窑树穴30—60 cm)样品之间的相似度最高，相似系数达到0.800；道朗连作园各样品之间土壤真菌相似性系数在0.261—0.714之间，处于中等相似与中等不相似之间，以11号(道朗树穴30—60 cm)与12号(道朗株间30—60 cm)样品之间的相似度最高，相似系数达到0.714；金城连作园各样品之间土壤真菌相似性系数在0.435—0.800之间，金城30—60 cm土层行间、树穴、株间各样品之间处于中等相似与中等不相似之间，其他各样品之间处于极相似与中等相似之间。磁窑、道朗和金城连作园的各样品之间土壤真菌群落结构的相似性则处于极不相似与中等不相似之间。

根据主成分的提取原则，被选的主成分所代表的主轴总长度占所有主轴长度之和的大约85%即可，本文对各样品获得的所有数据进行主成分分析，前3个主成分特征值的贡献率总和为83.8%，后面的特征值的贡献越来越少，所以本文选取3个主成分来进行分析(图 4)。由图 4可以看出，磁窑、道朗和金城连作园的所有样品可以分为3个相对独立的群，磁窑连作园的所有样品具有最高的第一主成分得分和较低的第二、第三主成分得分；道朗连作园的所有样品仅具有最高的第二主成分得分；金城连作园的所有样品仅具有最高的第三主成分得分。磁窑、道朗和金城连作园的土壤真菌群落结构均有明显差异，各自构成1个独立的群落结构。

图4 不同样品间T-RFLP图谱的主成分分析 Fig.4 PCA for T-RFLP patterns of different samples 图中阿拉伯数字1,2,3代表每个样品进行的3次平行重复

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连作障碍的发生与根际微生态系统的失衡密切相关，长期连作可导致根际微生物群落结构和功能多样性改变，降低有益微生物数量，增加土传病害菌数量，从而导致作物减产^{[23, 24]}。果树连作障碍不仅导致病原菌如疫霉、腐霉和丝核菌等种群数量的明显增加，而且还影响土壤微生物的种群结构，在未栽培果树土壤中以腐生真菌、巨大芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德菌等细菌为主，而连作土壤则以病原真菌为主^[25]。已报道与苹果连作障碍有关的主要致病真菌属有柱孢属、镰刀属、丝核属、疫霉属和腐霉属等^[26-27]。Tewoldemedhin^[5]从连作果园苹果腐烂的根中分离到了大量的尖孢镰刀菌。Van Schoor^[4]研究发现在南非所有连作苹果园中土壤有害真菌镰刀属、柱孢属以及腐霉属是引起连作障碍的主要原因，真菌是某些地区导致苹果连作障碍的主要原因，病原菌往往是许多真菌组成的真菌复合体。

多样性分析结果显示连作苹果园不同取样位置的真菌多样性存在差异，磁窑、道朗和金城三片连作园中均表现为树穴处理具有最高的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和最低的优势度指数，可能是因为树穴中残留许多老果树根系向土壤环境释放的代谢产物，其主要包括糖类、蛋白质、氨基酸、维生素以及有机酸、酚类等化合物^[28]，其中很多低分子量的化合物可作为化感物质影响植物根际土壤中微生物群落^{[29, 30]}。当根系分泌物中自毒物质积累较少时，根系分泌物给病原菌提供丰富的营养，从而使病原菌数量和种类较丰富，多样性指数较高^[31]。张淑香等^[32]和刘金波等^[33]证明连作后根系分泌物的数量增多会诱导土壤真菌数量的增加。众多研究也表明，连作导致致病真菌的增加绝不是偶然现象，而是与连作及连作产生分泌物密切相关^[34]。这些物质对微生物和植株具有自毒作用，连续种植可导致其积累，进而发生连作障碍^[35]。

微生物是土壤生态系统中最具活力的组成部分。根际是植物与土壤环境接触的重要界面，植物根系以多种形式向周围的土壤释放有机物质，并以其自身的活动影响这部分土壤的理化及生物学性状，特别是影响微生物区系的发育^[36]。自然条件下，不同的植物根系有不同的分泌物、不同的根部碎片和其它有机成分，形成根际独特而稳定的微生物区系^[37]。砧木、树势及季节变化等因子对土壤微生物的种群结构、分布和数量均有显著影响^[38]。马宁宁等^[39]研究发现对于土壤土著微生物来说，土著真菌的群落结构稳定性优于土著细菌，优势种群没有因为受到温度、湿度、人为耕作措施等的影响而消失。PCA和聚类分析结果显示磁窑、道朗和金城连作园的土壤真菌群落结构均有明显差异，且磁窑、道朗和金城连作园的土壤真菌群落结构处于极不相似与中等不相似之间，说明磁窑、道朗和金城连作园土壤中已经形成了稳定的土著真菌群落，这些群落能够适应磁窑、道朗和金城连作园各自土壤环境中的变化并成为环境的优势群落，各自构成1个独立的群落结构。

苹果连作障碍的病因复杂，土壤真菌对重茬再植植株的影响起着重要的作用，不同地区病因不同，即使同一地区，主要病因也存在细微差别^[3]。导致连作障碍发生的原因很多，如植物种类、土壤类型、栽培措施、连作年限等，果树的长期定植引起了土壤理化性质及土壤微生物数量、活性、多样性及种群结构的改变，果园土壤有机质含量降低、土壤酸化、微生物数量减少、活性及多样性改变是土壤质量退化的标志^[40]，但最重要的是连作改变了土壤微生物的种群结构和数量，一些依赖于植物及其代谢产物的微生物种群(尤其是病原菌)数量逐渐转变为优势种群，相反，一些受植物代谢产物抑制的微生物种群(一些有益微生物)数量将逐渐降低。连作后的这种有益与有害微生物种群结构和数量的失衡，土壤真菌群落结构变化可能是导致连作障碍严重发生的重要原因之一。