2014, Vol. 34文章信息
- 刘方春, 邢尚军, 马海林, 陈波, 丁延芹, 杜秉海
- LIU Fangchun, XING Shangjun, MA Hailin, CHEN Bo, DU Binghai
- 持续干旱对樱桃根际土壤细菌数量及结构多样性影响
- Effects of continuous drought on soil bacteria populations and community diversity in sweet cherry rhizosphere
- 生态学报, 2014, 34(3): 642-649
- Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(3): 642-649
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201211061552
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文章历史
- 收稿日期：2012-11-6
- 修订日期：2013-3-4
2. 山东农业大学生命科学学院,泰安 271018
2. College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化和循环的动力，对土壤肥力的形成起着积极的作用[1, 2]。土壤微生物群落结构是土壤生态功能的基础，与土壤的化学性质、土壤团聚体的形成等密切相关[3]，群落结构的改变可以作为预示土壤变化的指标[4, 5]。土壤微生物结构容易受外界环境，比如盐分、温度、湿度等的影响而发生变化。
干旱是限制植物产量最重要的环境因子，也是影响树木成活与生长的重要限制因子[6]。大量研究表明，干旱可影响植物调节酶含量、刺激部分植物根系生长、限制植物生长等[7]。而关于干旱与土壤微生物之间相互关系的研究很少。有研究表明，干旱对土壤微生物具有较大的影响，接种一些微生物可提高植物的抗干旱能力。Liu等发现在美国新墨西哥州北部沙漠牧场中，夏季干旱试验区的微生物多样性比夏季和春季的对照中低[8]；也有研究表明，土壤中接种微生物后，可缓解干旱对植物的伤害，提高草坪植物的抗旱性，并可促进植物生长[9, 10]。然而不同强度的干旱对根际土壤微生物数量，尤其是群落结构多样性的影响不得而知。YT3是从樱桃根际土壤中筛选出的一株植物根际促生细菌，由于根际促生细菌的专一性，本文以1年生吉塞拉实生容器苗为试材，以荧光蛋白标记后的YT3-gfp作为指示细菌，研究了持续干旱对樱桃根际土壤细菌数量和群落结构多样性的影响，旨在揭示干旱对根际土壤微生物特征的影响，为植物的合理灌溉提供理论和科学依据。
1 材料和方法 1.1 供试材料樱桃苗(Cerasus pseudocerasu)为山东省林科院利用无纺布容器育苗技术繁育的1年生‘吉塞拉’实生容器苗，平均株高为(55.7±1.87) cm，平均地径(0.89±0.03) cm。供试土壤类型为潮土，来源于山东省林科院的试验苗圃，其速效氮、速效磷和速效钾含量分别为54.3、34.2 mg/kg和102.4 mg/kg，有机质为8.90 g/kg，pH为7.95。
YT3是从樱桃根际土壤筛选出的1株根际促生细菌，通过对其进行形态学观察、生理生化测定以及16S rDNA序列及系统发育分析，将其鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No. 5319)。YT3-gfp是 YT3的绿色荧光蛋白标记菌，供体菌和辅助菌分别为中国农业大学提供的S17-1(pMP2444)和MM294(pRK2013)，通过三亲本杂交的方法将外源基因导入受体菌。YT3-gfp的荧光镜检图片及菌落形态如图1所示。将YT3-gfp在非选择压力下以1%的接种量连续转接6次(24 h/次)后，质粒丢失率为6%，标记基因质粒在受体菌中可稳定遗传。
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| 图1 YT3-gfp的荧光镜检图片及其菌落形态 Fig. 1 Picture of YT3-gfp by fluorescence microscopy and its colony morphology |
试验于2011年5—8月在山东省林业科学研究院的塑料大棚中进行，采用盆栽试验，随机区组设计。盆高20 cm，宽30 cm，每盆装土13 kg。2011-5-27将樱桃容器苗定殖，然后将100 ml YT3-gfp菌液均匀浇灌于樱桃根系周围，加入的总活菌数约为30×108 CFU。2011-7-12挑选长势一致的樱桃盆栽苗开始干旱胁迫试验。共设置6个水分处理，以7 d为一个处理周期，分别连续干旱7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d后，分别记作D7、D14、D21、D28、D35和D42。按照试验设计(表 1)在不同日期进行灌溉，每次灌溉均浇水至土壤田间持水量的85%。2011-8-23干旱胁迫结束时，各试验处理的相对含水量分别为田间持水量的76.59%(湿润)、65.78%(较适宜)、60.68%(适宜)、51.25%(轻度干旱)、42.74%(中度干旱)和33.19%(重度干旱)。采用剥落分离法取样，将带土植株取出，先轻轻抖落大块不含根系的土壤(非根际土)，然后用力将根表面附着的土壤全部抖落下来，迅速装入塑料袋内(根际土)[11]。根际土用于YT3-gfp数量、细菌、放线菌、真菌和T-RFLP的测定，非根际土用于YT3-gfp数量的测定。
| 处理Treatments | 处理时间 Treat time (月-日 Mounth-day) | ||||||
| 07-12 | 07-19 | 07-26 | 08-02 | 08-09 | 08-16 | 08-23 | |
| +正常浇水；-停止浇水；D7、D14、D21、D28、D35和D42分别表示连续干旱7、14、21、28、35 d和42 d | |||||||
| D7 | + | + | + | + | + | + | - |
| D14 | + | + | + | + | + | - | - |
| D21 | + | + | + | + | - | - | - |
| D28 | + | + | + | - | - | - | - |
| D35 | + | + | - | - | - | - | - |
| D42 | + | - | - | - | - | - | - |
YT3-gfp数量的测定：用无菌水系列倍比稀释土壤样品，分别吸取100 μl，悬浮液涂布LB抗性平板，37 ℃培养24—48 h后，根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号(图1)鉴定并计数YT3-gfp的数量。
三大功能微生物数量的测定采用稀释平板法。土壤微生物种群数量测定采用稀释平板法。真菌的测定采用马丁培养基+孟加拉红+硫酸链霉素；放线菌的测定采用改良高氏1号培养基+重铬酸钾；细菌的测定采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。用0.1 ml消毒移液管取每个稀释度悬液，无菌操作，接种于消毒培养皿，重复3次，每种菌均以不加悬液的消毒蒸馏水作空白对照。
T-RFLP的测定：样品基因组总DNA的提取纯化使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit(美国OMEGA公司)。采用上游引物27F-FAM(5-FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和下游引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)扩增16S rDNA。PCR反应条件及产物回收均参考宋洪宁(2010)等人的方法[12]。酶切产物用ABI 3730测序仪扫描，扫描结果采用Peak Scanner Software v1.0分析。
1.4 统计分析细菌群落多样性分析：单个T-RF(Terminal Restriction Fragment)的相对峰面积(Ap)通过公式Ap=ni/N×100进行计算(ni为单个T-RF的峰面积，N为图谱中所有峰的面积的总和)。Ap值采用片段长度在50—500 bp区间且大于1%的T-RF数值进行统计分析。以图谱中每一个可统计的T-RF视为一个OTU(operational taxonomic unit)，以T-RF的相对峰面积作为对应的OTU的丰度。根据图谱中OTU的种类及其丰度通过BIO-DAP程序进行多样性分析。根据T-RFs在不同样品图谱中的分布及丰度，采用SPSS软件对样品进行主成分分析[12]。 利用Phylogenetic Assignment Tool (http://secure.limnology. wisc.edu/trflp/)对主要的T-RFs所代表的物种进行推测。
YT3-gfp及三大功能微生物数量的显著性检验采用Excel 2007和SPSS软件进行相关分析，结果为3次重复试验的平均值，变异系数的计算公式为：变异系数=(标准差/平均值)×100%[13, 14]。
2 结果与分析 2.1 YT3-gfp数量持续干旱对樱桃土壤中的YT3-gfp数量影响(图2)可以看出，在不同干旱强度条件下，根际土壤中YT3-gfp的数量是非根际土壤中的8.75—28.77倍。可见，YT3主要是定殖于樱桃根际土壤中，而非根际土壤中定殖数量非常少。持续干旱对YT3-gfp的数量影响显著，不同处理间差异达显著水平。无论是根际土壤还是非根际土壤中，随着干旱强度的增加，YT3-gfp的数量逐渐增加，达到某一干旱强度后又开始逐渐降低。根际土壤和非根际土壤中的YT3-gfp数量分别在干旱持续第21天和28天时达最大值，分别为166×104 CFU/g土和6.7×104 CFU/g土。此外，根际土壤中，不同干旱强度对YT3-gfp数量影响的变异系数为50.89%，而对非根际土壤影响的变异系数仅为11.32%。由此可见，根际土壤中YT3-gfp数量受持续干旱的影响显然大于非根际土壤中受到的影响。
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| 图2 不同干旱强度下樱桃实生苗土壤中的YT3-gfp数量 (M±SD) Fig. 2 Effect of continuous drought on YT3-gfp populations in the soils of sweet cherry seedlings (M±SD) |
表 2显示了持续干旱对樱桃根际土壤中三大功能微生物数量及微生物总量的影响，可以看出，樱桃根际土壤中微生物以细菌为主，不同干旱强度下，细菌占微生物总量的比例为63.76%—88.53%，放线菌比例为11.42%—36.03%，而真菌所占比例仅为0.059%—0.27%。不同干旱强度对土壤中可培养的微生物数量影响显著，随着干旱时间的延长，根际土壤中可培养细菌和放线菌的变化趋势基本一致，呈先增加后减少的趋势，分别在干旱胁迫至第21天和28天时数量最高。受细菌数量变化的影响，在干旱胁迫至21 d时，根际土壤的微生物总量最高。真菌数量变化趋势同细菌和放线菌有所不同，随着干旱时间的持续增加，真菌数量呈一直减少的趋势，干旱胁迫至42 d时真菌数量仅为7 d时的53.40%。从不同功能微生物菌落变化的变异系数值可以看出，干旱对细菌影响的变异系数最大，放线菌次之，而真菌最小[13, 14]。
| 处理 Treatments | 细菌 Bacteria /×106 | 放线菌 Actinomycetes /×105 | 真菌 Fungus /×104 |
| 小写字母为LSD多重比较结果，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P < 0.05)；②变异系数 | |||
| D7 | 11.40±1.01 cd | 40.67±5.01 d | 4.11±0.28 a |
| D14 | 31.03±2.54 b | 53.01±4.29 c | 4.17±0.31 a |
| D21 | 48.33±5.17 a | 62.33±4.65 b | 3.20±0.21 b |
| D28 | 18.87±2.34 c | 83.33±5.54 a | 2.93±0.22 b |
| D35 | 8.73±1.31 d | 49.33±3.29 c | 2.97±0.26 b |
| D42 | 8.30±1.24 d | 35.03±1.98 d | 2.19±0.19 c |
| CV② /% | 75.08 a | 32.01 b | 17.13 c |
不同实验处理根际土壤的T-RFLP图谱如图3所示，图片中的每个峰相当于一种细菌，峰越多则细菌种类越多，峰面积代表该细菌的含量。可以看出，6种不同干旱处理均在66 bp、91 bp和136 bp条带下具有优势T-RFs。共有条带中，随着持续干旱强度增加的变化趋势差异很大。一些条带相对峰面积始终差异不大(66 bp)，一些条带相对峰面积呈减少趋势(91 bp)，而一些条带在持续干旱至某一程度时达到最大值(136 bp)。在一些特有条带中，部分条带随着干旱胁迫持续的增加呈降低趋势，甚至有部分条带会消失(91 bp、127 bp、138 bp、148 bp和150 bp)；持续干旱至某一强度时，会出现一些特有条带，干旱强度再增加，特有条带则会消失(57 bp、88 bp和262 bp)。
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| 图3 不同试验处理冬枣樱桃实生苗土壤的T-RFLP图谱 Fig. 3 T-RFLP profiles of drought treatments in the rhizosphere soils of sweet cherry seedlings |
将T-RFs数据输入Phylogenetic Assignment Tool数据库进行比对，对图谱中优势峰可能代表的物种进行了推测。结果表明，除了57 bp的优势峰无法推测外，图谱中一些优势峰可能代表的物种为： Actinobacteria (66 bp),β-Proteobacteria/γ-Proteobacteria/ Bacteroidetes (88 bp),γ-Proteobacteria/ Bacteroidetes/ Actinobacteria(91 bp),α-Proteobacteria/β-Proteobacteria/ γ-Proteobacteria/ δ-Proteobacteria(127 bp),β- Proteobacteria/γ-Proteobacteria /Firmicutes/ Actinobacteria (136 bp),γ-Proteobacteria/ Firmicutes(138 bp),α- Proteobacteria/ β-Proteobacteria / Actinobacteria/ Firmicutes (148 bp),α-Proteobacteria/ Firmicutes/Actinobacteria(150bp),Firmicutes(262 bp)和α-Proteobacteria/ Firmicutes(437 bp)。
2.3.2 多样性指数分析根据T-RFLP图谱(图3)中的OUT的数量、种类及丰度，分别计算6个土壤样品的细菌多样性指数(表 3)。可以看出，持续干旱对樱桃实生苗根际土壤的细菌群落结构多样性产生较大影响。随着持续干旱强度的增加，樱桃实生苗根际土壤Margalef 指数(丰富度指数)和Shannon指数(多样性指数)逐渐升高，在干旱胁迫至第21天时，基本达到最高值，而Simpson′s 指数(优势度指数)逐渐降低，在干旱胁迫至第28天时最低。持续干旱从第35天到第42天时，根际土壤的Margalef 指数和Shannon指数迅速降低，而Simpson′s 指数急速上升，说明干旱胁迫超过35 d，土壤细菌群落结构多样性受到较为严重的影响。
| 处理 Treatments | 马格列夫指数Margalef index | 香农指数 Shannon index | 辛普森指数 Simpson′s index |
| Margalef index(丰富度指数)；Shannon index(多样性指数);Simpson′s Index(优势度指数) | |||
| D7 | 2.704±0.196 b | 2.154±0.134 c | 0.122±0.008 bc |
| D14 | 2.964±0.121 b | 2.231±0.135 bc | 0.096±0.004 c |
| D21 | 3.419±0.139 a | 2.699±0.109 a | 0.081±0.004 d |
| D28 | 2.981±0.112 b | 2.311±0.124 b | 0.075±0.006 d |
| D35 | 2.721±0.176 b | 2.040±0.098 c | 0.102±0.008 c |
| D42 | 0.946±0.062 c | 0.889±0.052 d | 0.421±0.024 a |
根据T-RFs在持续干旱根际土壤样品图谱中的分布及丰度进行主成分分析(PCA)，结果显示，第一主成分方差贡献率66.22%，第二主成分方差贡献率16.45%，第三主成分方差贡献率9.06%，三者贡献和为91.73%，可以代表整个系统状况。6个处理T-RFLP图谱的PCA结果显示(图4)，持续干旱对细菌多样性影响可以分为3个相对独立的群，持续干旱14—35 d时距离较近，可视为一个相对独立的群，而持续干旱7 d和42 d时，可视为另外两个相对独立的群。这说明本实验条件下不同干旱时间对根际土壤细菌群落多样性有强烈影响，干旱时间太长(42d)或者太短(7d)均会造成根际土壤细菌多样性下降，而适度干旱(14—35d)可不同程度的提高细菌群落结构多样性。
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| 图4 基于土壤样品T-RFLP图谱的主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis for T-RFs of T-RFLP profiles in different treatments |
本研究借助绿色荧光蛋白基因标记技术，利用樱桃实生苗根际促生细菌YT3的标记菌YT3-gfp作为目标菌，研究持续干旱对微生物数量的影响。研究发现，在不同干旱强度下，樱桃实生苗根际土壤中的YT3-gfp数量是非根际土壤中的8.75—28.77倍，说明根际促生细菌YT3主要定殖在樱桃根际土壤中，这与前人的研究结论基本相似[15, 16]。因此，本研究中使用的YT3-gfp可以代表根际土壤微生物。
持续干旱对YT3-gfp种群数量产生了显著影响。非根际土壤中的数量较少，随干旱强度变化的幅度较小，而根际土壤中的数量较大，随干旱强度的持续增加，YT3-gfp呈现逐渐增加而后又开始减少的趋势。不同干旱强度下YT3-gfp数量变化的变异系数反应出，持续干旱主要是影响到了根际土壤中的YT3-gfp数量变化。因此，持续干旱主要是对根际土壤中的微生物数量产生较大影响。微生物活性需要根系分泌物中的一些有机物质作为能量来源[17]，干旱会影响到根系的生长和根系活力，从而影响到根系分泌物质的含量，影响根际土壤中的微生物数量。有研究报道，植物受到干旱胁迫时，生物量优先向根系分配[18]，侧根和根系总长度增加，>1 mm的侧根数目显著增加，根系活力有所增强[19]，根系活力及根系形态的变化可能会改变根系分泌物质的数量。因此，在胁迫程度适中时，根系活力最强，根系分泌物质势必增加[20]，导致细菌所需的有机碳能源增加，从而导致YT3-gfp数量在一定干旱程度时最高；而随着干旱程度的持续增加，根系生长及活力明显受到抑制，YT3-gfp数量开始受到抑制，数量下降。
3.2 对三大功能微生物数量影响在不同干旱强度的条件下，细菌占微生物总量的比例为63.76%—89.49%，放线菌比例为10.46%—36.03%，而真菌所占比例仅为0.11%—0.30%，土壤中微生物以细菌为主，这与前人的研究结论基本一致[21]。由于土壤中细菌、真菌和放线菌差异很大，不能通过标准差看出干旱对3种功能微生物的影响程度。通过变异系数可以反应干旱对三大功能微生物影响程度的大小。结果显示干旱强度的增加对三大功能微生物影响并不一致，对细菌影响最为显著，放线菌次之，而对真菌影响最小。这应该与不同微生物在根际土壤中所占比例差异有关。随着干旱强度的增加，根际土壤中细菌和放线菌呈先增加后减少的趋势，而真菌则一直减少。前面分析可知，土壤中细菌数量大，所需能源物质多，受根系活动影响明显。随着干旱强度的增加，根系活动的变化导致了细菌数量呈规律性的变化。而土壤中的真菌数量相对很少，所需能源物质较少，根系活动对其产生的间接作用也较小。土壤中的病源菌多为一些真菌[22]，因此，持续干旱可能会对一些土传病害有抑制作用。有研究发现一定程度的干旱条件下，更有利于细菌作用的发挥[10]，也有研究报道，土壤真菌和放线菌比固氮菌更容易适应干旱条件[23]。而本研究结果认为细菌比真菌更容易适应干旱条件，与前人研究结果并不完全相同。这可能与微生物生长条件、供试土壤种类及干旱胁迫强度的差异等原因有关。
3.3 对细菌群落结构多样性影响由于研究方法的局限性，土壤中约有80%—99%的微生物未被认识和鉴别，通过常规手段不可能获得全面的信息[24]。T-RFLP技术可获得土壤微生物系统的发育信息，是一种非常有效的评价土壤微生物群落多样性的方法[25, 26]。在外在环境一致的前提下，本研究着重研究了不同干旱强度对樱桃实生苗根际土壤中细菌多样性影响。基于T-RFLP图谱的多样性指数分析说明，干旱对根际土壤中的细菌的种类及丰度产生了很大影响。一定强度的干旱可提高樱桃实生苗根际土壤中的细菌群落结构多样性，而过度干旱或者过度湿润导致细菌群落结构多样性指数降低。从T-RFLP图谱主要片段定性分析结果分析，持续干旱对Actinobacteria影响较小，而γ-Proteobacteria/ Bacteroidetes/ Actinobacteria 的数量随干旱胁迫强度的增加逐渐减少，诸如β-Proteobacteria/ γ-Proteobacteria / Firmicutes/ Actinobacteria等一些物种在不同干旱强度下均有一定的比例存在，但在适宜干旱强度下数量更高。β-Proteobacteria/γ-Proteobacteria/Bacteroidetes和Firmicutes等一些物种只有在适宜的干旱强度下才会出现，而干旱强度过大或者过小的环境下下并不会成为优势菌群。基于土壤样品T-RFLP图谱的主成分分析结果显示，持续干旱至第14—35天时构成一个相对独立的群，细菌群落多样性指数也较高，而持续干旱7 d和42 d构成另外两个相对独立的群。在实际应用中，适度的干旱对于维持土壤微生物群落结构的多样性是有益的，土壤含水量过高或者干旱持续时间过长，均会造成根际土壤中的微生物群落结构失去平衡，从而影响植物的正常生长。
大量研究表明，不同的环境条件，诸如温度、土壤性质或其他土著微生物活力等均会对土壤微生物造成影响[8, 11, 27, 28]。土壤含水量不同，势必会引起土壤养分有效性、土壤通气性、pH和Eh等土壤理化性质的改变，而这些变化可能会对土壤微生物产生一定影响，这也将是我们未来研究的重点。
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