2014, Vol. 34文章信息
- 吴小红, 简燕, 陈晓娟, 李宝珍, 袁红朝, 葛体达, 邹冬生, 吴金水
- WU Xiaohong, JIAN Yan, CHEN Xiaojuan, LI Baozhen, YUAN Hongzhao, GE Tida, ZOU Dongsheng, WU Jinshui
- 自养微生物同化CO2的分子生态研究及同化碳在土壤中的转化
- Molecular mechanism on carbon dioxide assimilation of autotrophic microorganism and carbon translocation in agricultural soils
- 生态学报, 2014, 34(3): 701-709
- Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(3): 701-709
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201211051538
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文章历史
- 收稿日期：2012-11-5
- 修订日期：2013-3-4
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 湖南农业大学生物科技学院,长沙 410128
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
全球变暖和大气中CO2等温室气体浓度持续升高已是不可争辩的事实。虽然控制温室气体排放是当前减缓和适应气候变化的首要措施[1]，但是通过陆地和水生生态系统的大气CO2同化功能(生物固碳)增强碳固定，是目前应对气候变化最经济、最有效的途径[2]。生物固碳是通过植物或微生物的循环途径，将CO2转化成有机物质，提高生态系统的碳吸收和储存能力[3]。在生物同化大气CO2过程中，科学家们主要集中于陆地植被通过光合作用的碳同化过程。而自养微生物广泛分布于不同的生态系统中，具有很强的环境适应能力，可以在多种环境条件下如火山口[4]，海洋深处[5]，极地湖泊[6]等植物无法生存的生境中参与CO2的同化。因而从整个生物圈的物质、能量流来看，研究自养微生物的CO2同化功能具有重大的意义。
土壤是陆地生态系统中最大的碳库，同时也是地表生态系统最活跃的碳库之一。农业土壤最大可以抵消20%的全球CO2排放当量，此减排水平与我国农田土壤固碳潜力基本相当[7]。然而，在陆地生态系统碳库中，农田土壤碳库易受人为活动(耕作、施肥、灌溉等)干扰而对区域及全球环境造成重大影响。目前，对气候变化下的农田土壤碳平衡变化预测，最大的困难来自对农田土壤碳循环及其机制认识的不全面性和不确定性，土壤微生物与碳循环过程之间复杂的交互耦合作用更增加了研究的挑战性。因此，开展农田土壤自养微生物CO2同化功能及其同化碳转化和稳定的分子生态学机制研究，这将推进对微生物介导的土壤碳过程及陆地生态碳循环机制的认识，为农业生产中采取合理有效的措施提升土壤有机碳含量和土壤生产力功能提供理论支撑。
1 自养微生物CO2同化机制
自养微生物同化CO2的途径有5条[3, 8]，即卡尔文循环、还原性三羧酸循环途径、厌氧乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸途径和琥珀酰辅酶A途径。其中，卡尔文循环(Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle)可分3个阶段：(1)羧化反应；(2)还原反应；(3)CO2受体的再生(图1)，是自养生物CO2同化以及陆地生态系统初级产物合成的最主要途径，在调节大气CO2浓度方面发挥重要作用[8]。CO2同化效率影响着土壤碳库的输入与输出及土壤的相关生态过程。过去的很多研究关注着大气CO2浓度倍增对土壤微生物群落的影响[9, 10]。然而本实验室最新研究[11]表明农田土壤自养微生物(主要是不产氧兼性自养菌)，能通过卡尔文循环将CO2转化成有机物质，其同化速率约为0.0134—0.103 g C m-2 d-1，对提高生态系统的碳吸收和储存同样有着重要意义。该结果将改变人们对微生物在陆地生态系统碳循环中仅担负有机质分解、矿化功能的长期认识。
核酮糖-1,5-二酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)催化卡尔文循环中的第一步CO2固定反应[12]，即1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)的羧化反应，是卡尔文循环中碳同化的限速酶。RubisCO酶有FormⅠ、FormⅡ、FormⅢ和FormⅣ 4种类型[8, 13]，广泛分布在绿色植物和自养微生物中。虽然RubisCO的结构多样，但其催化过程是一致的。Takai等[14]分离的1株Epsilonproteobacteria菌的酶活性高达222 nmol CO2 mg-1 蛋白质 min-1，而Meeks[15]分离获得的一株蓝细菌(点形念珠藻，Nostoc punctiforme)，RubisCO酶活性仅19.8 nmol CO2 mg-1 蛋白质 min-1，明显低于其它纯培养获得的变形菌RubisCO酶活性。尽管以前有关RubisCO酶活性的研究取得很多方面的进展，但均集中于植物或者纯培养的细菌，关于土壤RubisCO酶活性研究还鲜见报道。Yuan等[11] 2012年通过微宇宙培养结合碳同位素示踪技术，发现供试农田土壤微生物具有较高的RubisCO酶活性(9.67—50.85 nmol CO2 mg-1蛋白质·min-1)，并且酶活性与碳同化速率呈显著正相关关系(r=0.945)，提出了以RubisCO酶活性指示土壤自养微生物碳同化潜力的估算方法，较高的RubisCO酶活性意味着较高的自养微生物碳同化潜力。相比碳同化功能基因，RubisCO酶活性可以更好地反应土壤微生物固碳潜力。
RubisCO必须处于活化状态才能催化底物RuBP的羧化反应。RubisCO的活化机制有两种：体外活化和体内活化。前者是一个依赖pH值、CO2浓度、Mg2+与酶结合的过程[16]。RubisCO还可以借助另一种酶-RubisCO活化酶的激活作用进行体内活化，该过程需要合适的CO2和Mg2+浓度、未被活化的RubisCO以及RuBP等条件。RubisCO活化酶能促进RuBP等抑制剂从RubisCO解离，使CO2更易进入活化位点，加速RubisCO的氨基甲酰化作用[17]。 RubisCO活性受环境因子(包括光照强度、温度、湿度、CO2浓度)和生理因子(包括pH值、Mg2+浓度、ATP/ADP比值)的影响[16]。此外，磷酸化代谢产物(6-磷酸葡萄糖、果糖、NADPH)、催化底物RuBP本身以及无机阴离子(硫酸盐、无机磷酸盐)等竞争性抑制剂也会影响RubisCO活性[18]，但这些抑制剂对RubisCO活性的影响程度有待进一步研究[17]。Marcus等[19]以蓝细菌synechocystis sp. 6803为研究对象，研究了磷酸盐在不同结合位点的吸附对RubisCO酶活性的调控机制，发现磷酸盐与底物RuBP在不同结合位点的竞争吸附均会抑制RubisCO酶活化。目前，有关土壤自养微生物RubisCO酶活性影响机制的研究还较少，Yuan等[20]认为土壤自养微生物RubisCO酶活性受土壤有机质含量的影响，秸秆还田能显著增加RubisCO酶活性，增加土壤碳固定量。
2 陆地生态系统碳同化微生物的分子生态学机理由于编码RubisCO酶的cbbL和cbbM基因具有高度保守性，因此可以借助现代分子生物学技术，通过分析环境样品中cbbL和cbbM功能基因的多样性进而研究自养微生物碳同化的分子生态学机制。目前，利用cbbL和cbbM功能基因，从DNA和RNA水平研究此过程及其对不同生境的响应和反馈已成为这一领域的研究热点。
2.1 DNA水平上碳同化微生物分子生态学机理研究近年来，有关湖泊[21]、地下水[22]、海洋[23]和深海盆地[24]等水生生态系统中碳同化微生物碳同化能力及其多样性的研究已取得较大进展，但有关陆地生态系统RubisCO编码基因(cbbL)多样性的研究较少。对陆地生态系统cbbL功能基因多样性的研究始于2004年，该研究主要针对不同年限火山灰中化能自养菌多样性的进行了分析[4]。随后，该实验室通过cbbL基因对距离自然CO2排放源不同距离的土壤中化能自养菌的群落结构和多样性进行了研究[25, 26]。这些研究表明，这几类土壤均以兼性化能固碳自养微生物为主，但在不同年限以及距离CO2排放源不同距离的土壤中获得的cbbL基因序列多样性差异很大，说明兼性固碳自养微生物的群落结构受生境影响很大。
对农田生态系统的研究主要集中在自养固碳微生物种群多样性及其对环境条件的响应，研究发现了很多新的自养微生物固碳基因型，但这些碳同化微生物在土壤中所起的具体作用和贡献有待进一步研究和验证[25, 27, 28, 11]。从cbbL功能基因多样性着手研究农田土壤微生物固碳过程仅是一个开端。Tolli 和King[25]利用cbbL基因作为固定CO2自养细菌的功能标记物，首次对不同农业生态系统不同层次土壤中化能自养微生物的群落结构和多样性进行了研究,结果表明土壤中以兼性固碳自养菌为主。受作物类型、土地利用方式和土层深度的影响，土壤中cbbL基因多样性差异很大。此后，研究者相继通过cbbL基因研究了不同农田管理方式对CO2同化微生物多样性的影响[27, 28]。研究发现所有供试土壤兼性固碳自养菌的多样性均高于专性固碳自养菌，但不同研究区域兼性固碳自养菌群落结构存在较大差异。施肥处理能使兼性自养固碳菌增加而严格自养固碳菌生长受到抑制。Miltner等认为这可能是异养微生物对有机肥碳源的竞争抑制了严格自养菌(携带green-like基因)的生长[28]。Yuan等[20]研究了不施肥(CK)，施氮、磷、钾肥(NPK)和秸秆还田(NPKS)3种长期施肥制度对稻田土壤固碳自养菌群落结构及数量的影响，结果表明长期施肥导致土壤固碳自养菌种群结构产生了明显差异，NPK和NPKS处理中兼性自养固碳菌增加而严格自养固碳菌生长受到抑制，通过分析固碳细菌cbbL基因文库发现，供试土壤含有cbbL基因的细菌群落以兼性自养菌为主。由于cbbL基因的单独存在并不能证明自养微生物发挥了碳同化作用，研究者还利用碳同位素标记结合功能基因cbbL分子标记技术，发现农田土壤固碳细菌和藻类cbbL 拷贝数分别为106―108 g-1土和103―106 g-1土，并且细菌cbbL基因拷贝数与碳同化速率呈显著正相关关系(r=0.903)[11]，说明农田土壤微生物碳同化过程主要是自养过程，参与该过程的微生物主要是自养菌和藻类，而非异养微生物。
2.2 RNA水平上碳同化微生物分子生态学机理研究一般来说，在DNA水平上检测到基因的存在并不意味着该基因得到了表达[29]，而RNA的存在能在很大程度上表明微生物基因处于活性状态，并驱动着重要的生物地球化学过程，因此环境转录组学研究可以更为明确地鉴别微生物在驱动过程中的功能作用。目前，通过cbbL基因从RNA水平上对自养微生物碳同化功能的研究主要集中水生生态系统。John等[30]研究发现，河流中浮游藻类在光饱和点的最大光合速率出现时间滞后于cbbL基因开始转录的时间，在大型浮藻中滞后时间更长。这说明CO2同化功能受cbbL基因转录水平的严格控制，而浮游藻类所处生境的生理生态特性包括光可利用性、光照时间、养分状况和CO2分压均会影响cbbL基因的转录[30, 6]。Kong 等[6]发现受有效光照和养分状况的影响，南极班尼湖不同类型cbbL基因转录活性随水层深度呈现不同的变化规律， FormID cbbL基因转录活性随水层深度增加而增加，而FormIA/IB cbbL基因呈现相反的规律。FormID cbbL基因表达量与光合有效辐射和光合速率有很好的耦合关系，表明夏冬季节交替时期含FormID cbbL基因的光能自养微生物是班尼湖固定CO2的主要贡献者。 cDNA文库分析结果表明这些光能自养微生物主要是分布在浅层水体(6m)的隐芽藻(Geminigera cryophila)、13m深处的鞭金藻(Isochrysis sp.)以及在不同水层均有分布的微拟球藻(Nannochloropsis)。Crépeau等[31]提取深海热液喷口场微生物垫RNA，反转录后，成功扩增了cbbL和cbbM基因，说明含cbbL和cbbM基因的自养微生物是深海环境中的初级生产者。Alfrider等[32]研究表明， cbbL和cbbM基因的表达与地下水的氧化还原特性有关，cbbL基因仅在充入工业氧气的地下水中表达，而cbbM基因仅在添加硝酸盐的地下水中表达，这些携带cbbL和cbbM基因的自养微生物是地下水系统中CO2固定的重要驱动者。
相对于水生生态系统，目前在RNA水平上对陆地生态系统，特别是农田生态系统自养微生物碳同化功能的分子生态学机制研究还很缺乏。农田是陆地生态系统中最活跃且固碳潜力最大的碳库之一[33, 34]，加强对农田土壤碳同化机制的研究可以为正确评估农田土壤固碳潜力提供科学依据。因此，通过环境转录组学研究(RNA研究)，鉴别农田土壤中具有碳同化功能的自养微生物，明确揭示驱动农田生态系统碳固定的微生物机制，将有利于加强对土壤碳过程及固碳机制的认识。
2.3 SIP技术在碳同化微生物分子生态学研究中的应用稳定同位素探针技术(SIP)是目前原位研究复杂环境关键元素生物地球化学循环微生物驱动机制的有力工具。该技术采用稳定同位素标记底物培养环境样品，通过分析标记的微生物基因组DNA(DNA-SIP)或者RNA(RNA -SIP)来揭示环境样品中同化了标记底物的微生物作用者，从而揭示环境中微生物重要代谢过程的分子机制[35]。利用DNA-SIP技术，Whitby等[36]通过添加13C-CO2和12C-CO2对淡水沉积物微生物基因组DNA进行标记培养，提取基因组DNA后进行超高速密度梯度离心，然后对13C-DNA模板进行PCR扩增并克隆测序，基因测序结果表明在实验室培养条件下淡水沉积物中的亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)具有CO2同化功能。此后，研究者们相继采用DNA-SIP技术分析了旱地土壤和农田土壤中受13C标记的氨氧化细菌，发现氨氧化细菌的大量DNA被标记，揭示了农业土壤中的氨氧化细菌，主要是亚硝化单胞菌(Nitrosospira sp.)和氨氧化菌(Nitrosospira multiformis)也具有同化CO2的能力[29, 37]。然而，研究发现在乙炔存在的条件下，这些氨氧化细菌的CO2同化能力会受抑制[29, 38]。具有CO2同化功能的氨氧化细菌在环境中广泛分布，而氨氧化古菌长期以来被研究者认为不具备同化CO2的能力。DNA-SIP技术的利用改变了这一认识。Zhang等[39]分别用13C-CO2和12C-CO2对酸性土壤进行标记培养，培养30d后提取土壤基因组总DNA并超高速离心后，对不同浮力密度DNA进行了分析，发现酸性土壤中奇古菌门(Thaumarchaeota)中的氨氧化古菌(AOA)具有CO2同化功能。
由于复杂环境样品中目标微生物特别是难培养微生物生长缓慢，目标微生物基因组DNA难以在较短时间内得到足够程度的稳定同位素标记，导致标记DNA难以有效分离。与DNA相比，RNA合成效率更快，可以在短时间内得到足够程度的标记[40]，因此，RNA-SIP技术为活性微生物分类鉴定和功能研究提供了更为灵敏的技术手段。Pratscher等[41]分别用13C-CO2和12C-CO2对旱地土壤标记培养12个星期以后，提取土壤DNA和RNA，采用SIP技术分析了受13C标记的氨氧化古菌的群落与功能。RNA-SIP分析结果则显示氨氧化古菌的大量RNA被13C标记了，说明旱地土壤的氨氧化古菌发挥了同化CO2的能力，由于被13C标记的DNA量低于检测限，所以DNA-SIP技术未能揭示氨氧化古菌的这一功能。系统发育分析表明这些氨氧化古菌主要是海洋亚硝化短小杆菌(Nitrosopumilus maritimus)和海绵共生古菌(Cenarchaeum symbiosum)。
由于SIP技术不依赖于培养，且能有效地将微生物的分类鉴定和功能联系起来，揭示复杂环境中微生物的生理代谢功能，该技术已被广泛应用于陆地生态系统碳循环的微生物驱动机制研究。通过对标记微生物基因组DNA或者RNA进行环境基因组学或转录组学研究，进而采用新一代高通量测序技术，可深入发掘具有碳同化功能的微生物或者与碳同化过程相关的新的功能基因。因此，SIP技术与组学技术的结合将会为未来陆地生态系统碳循环的微生物机理研究提供重要的技术手段。
3 同化碳在土壤中的转化与稳定性机理自养微生物同化碳输入土壤环境以后，一部分通过土壤呼吸作用以CO2和CH4的形式返回大气，剩下的成为微生物量碳中的一部分或以有机质形式储藏于土壤碳库中。研究同化碳(“新碳”)进入矿质土壤基质后的去向和转化特征，将有助于评价“新碳”输入对土壤有机碳库的贡献。进入土壤的“新碳”在土壤碳库中的矿化、转化与其稳定性有关，因此在固碳中有十分重要的作用。
3.1 同化碳在土壤中的转化目前，有关同化碳的转化研究主要集中在对根系分泌物和外源有机碳的转化研究上。根系分泌物转化是土壤碳循环中的一个重要过程，而根际微生物会影响根系分泌物的转化，因此，开展根际微生物与根系分泌物的相互作用研究具有重要的意义。根际分泌物主要由水溶性物质组成(含量为79%)，而水溶性物质中碳氢化合物占64%，氨基酸和氨基酸盐占22%，有机酸占14%[42]。根际分泌物的转化受生物因素如根际微生物群落结构[43]和植物类型[44]，以及非生物因素如土壤含水率、温度、土壤质地的影响[45]。Liang 等[46]通过盆栽实验采用13C稳定性同位素标记方法研究了玉米根际沉积碳中新碳的分布，发现土壤微生物碳库(MBC)和水溶性有机碳库(DOC)是新碳的主要去向，但新碳对MBC的贡献比对DOC贡献大。而Marx 等[47]的盆栽实验结果则显示，小麦根际沉积碳中的新碳主要分布在MBC和土壤总有机碳库中，而在DOC中未检测到新碳。
外源添加有机底物后进入土壤的“新碳”在土壤碳库中的转化与根际分泌物有所不同。Perelo等[48]和李玲等[49]分别在旱地和稻田土壤中添加标记的简单有机底物(葡萄糖)和复杂有机底物(植物秸秆或稻草)，研究土壤活性有机碳的动态变化，发现有机底物对稻田土壤DOC的影响较大，而对旱地土壤DOC影响较小。添加葡萄糖处理后，旱地土壤中14C标记DOC含量和MBC含量均高于添加植物秸秆处理，这是因为植物秸秆的某些成分如木质素难以被微生物降解，其生物可利用性比葡萄糖低。
3.2 同化碳在土壤中的稳定机制同化碳在土壤中的稳定性主要受到同化碳降解性的难易程度、土壤理化性质和土壤微生物群落的影响。
3.2.1 同化碳降解性难易程度通过根际沉积或者外源添加有机底物进入土壤的碳尤其是DOC是易被土壤微生物吸收利用的有机碳组分[50, 51]，10%—56%的土壤DOC具有生物有效性[52]。外源有机底物所含的DOC生物有效性更高，30%—95%的DOC组分可在3个月内被土壤微生物消耗掉[53]。DOC进入土壤后， 其中的碳水化合物和蛋白类物质最先被分解，而较难降解的复杂化学结构物质则不断富集(如具有芳香环结构的木质素和烷基结构的碳)。核磁共振(13C-CPMAS-NMR)分析结果显示随着有机碳不断分解，有机碳库中碳水化合物急剧减少，而具有脂肪烃结构和芳香结构的碳不断增加，但以脂肪烃为主[54]。此外，受土壤微生物作用的影响，某些高度易降解的DOC结构组成会发生变化，芳香化程度增加，DOC整体结构变得相对稳定[55]，使得DOC在溶液中的存留时间发生很大变化，易降解的DOC(如来源于新鲜植物残体)可以存留几个月，而难降解的DOC( 如来源于泥煤或森林土壤)甚至可以停留二三十年[56]。Sanderman和 Amundson[57]将室内试验与野外试验相结合，得出DOC在加利福利亚森林土壤中的平均存留时间达到90—150a。因此，难降解碳的累积有利于维持土壤碳库的稳定性。
3.2.2 土壤矿物与有机碳的相互作用进入土壤的新碳可以通过与有机矿质相互作用来抵制微生物对有机碳的分解，从而减缓有机碳的周转，促进其在土壤中的有效累积[58]。研究显示，新碳进入土壤后，土壤矿物质(氧化铁铝)的保护作用对土壤有机碳的稳定有着重要作用[59, 60]。培养实验结果表明，由于土壤矿物的吸附， DOC的矿化速率减缓了23%—64%[61]。随着DOC截留时间的增加，吸附在矿物表面的DOC会与矿物形成有机复合官能团而使其更难被矿化[60]。与碳水化合物相比，分子量较高的芳香化合物如疏水性化合物，富里酸和腐殖酸更容易被土壤矿物吸附[62]。Spaccini等[63]采用选择性有机组分提取、裂解组分化学鉴定和CPMAS联合13C核磁共振光谱分析(CPMAS-NMR)等技术，揭示了来源于玉米的新碳主要进入腐殖组分中，新鲜植物残体矿化分解的有机碳化合物主要存在于腐殖物质的亲水组分中，并可以进一步被疏水组分所稳定，从而对土壤中原有有机碳中的稳定组分起着新碳的汇的作用[64]。
3.2.3 团聚体的保护作用土壤团聚体对有机碳的包裹作用可以提高土壤有机碳的稳定性。土壤有机碳的水平通常与稳定性团聚体的数量有关[65]，而土壤微生物及其代谢产物对团聚体的形成有较大影响[66]。真菌菌丝可以促进土壤中水稳性团聚体的形成，保护有机碳含量增加[67]。团聚体结合的有机碳受到的物理保护程度跟团聚体的级别有关，通常表现为大团聚体的保护作用弱于微团聚体。研究者发现大团聚体内的有机碳寿命较短，一般只有几年，而微团聚体内的有机碳可达1个世纪[68]。
与根系分泌物和添加外源有机底物的转化与稳定性研究相比，有关自养微生物同化碳的相关研究还较少。Ge 等[69]采用同位素标记方法进行了100d的室内培养试验，结果发现与未种植水稻的土壤相比(自养微生物同化碳)，水稻同化碳的输入抑制了稻田土壤原有有机质的矿化，表现出明显的负激发效应，这对维持稻田土壤的碳汇功能具有十分重要的意义。尽管该结果在一定程度上丰富了对“新碳”的矿化、转化及其稳定性机理的认识，但是对于自养微生物同化碳对微生物生物量碳周转的贡献，以及自养微生物同化碳的矿化、转化特征及其稳定性差异形成的机理还有待深入研究。
4 研究展望目前，有关陆地生态系统自养微生物同化CO2的分子生态学研究主要是DNA水平上的研究。研究者们探讨了碳同化微生物数量和种群结构对施肥管理、作物类型、土壤质地和土壤深度的响应，发现了很多新的微生物固碳基因型，但有关这些固碳微生物在土壤中所起的具体作用还有待通过进一步证实。基于RNA水平对自养微生物CO2同化功能的分子生态学研究主要集中在水生生态系统，而有关同化CO2的自养微生物转录活性对陆地生态环境的响应及其对陆地生态系统固碳的调控机制研究还尚未见报道。采用碳稳定同位素示踪技术，结合基于RNA水平的分子生物学技术以及新一代高通量测序技术，可深入发掘具有碳同化功能的微生物或者与碳同化过程相关的新的功能基因。同时通过研究微生物同化碳在土壤碳库中的转化过程和稳定机制，可将碳同化微生物在土壤CO2同化过程中的贡献定量化，这些研究将推进对微生物介导的土壤碳过程及陆地生态碳循环机制的认识，为农业生产中采取合理有效的措施提升土壤有机碳含量和土壤生产力功能提供理论支撑。
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