随着我国城市规模的不断扩张，菜地资源日益减少，蔬菜连作现象十分普遍，病害发生严重。番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers. 侵染引起的真菌病害，发病面积大、危害严重，番茄产量损失可达30%以上^{[1, 2]}。目前，生产中缺乏高抗灰霉病的番茄品种^[3]，病害防治一直依赖化学药剂，但长期连续施用导致灰葡萄孢容易产生抗药性，常用的多菌灵、甲基硫菌灵、苯菌灵等苯并咪唑类等农药的防治效果已显著降低。此外，大量使用化学农药不仅影响番茄果实的安全性，危害人体健康，而且还造成严重的环境问题^{[4, 5]}。所以，研制高效、稳定、安全的生物农药，防治番茄灰霉病很有必要。

寡雄腐霉(Pythium oligandrum)属卵菌门(Heterokontophyta)，腐霉科(Pythiaceae)，腐霉属(Pythium)，能有效抑制灰葡萄孢Botrytis cinerea、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum和黑胫病菌Phytophthora nicotiana等多种植物病原真菌的生长繁殖^[6]。研究表明，寡雄腐霉抑菌的主要机理是寄生、抗生和竞争等作用^[7]，田间单独接种寡雄腐霉还能诱导植物抗病性^[8]，促进植物生理代谢和刺激生长^[9]。目前，欧美发达国家已制备出对人畜无毒安全，无环境残留的寡雄腐霉卵孢子制剂，用于蔬果的生产与保鲜^{[10, 11]}。但是，在大田应用孢子活菌剂时，生防效果依赖于卵孢子的萌发和菌丝生长繁殖，常受温度、湿度、光照(尤其是紫外线强度)、降雨、土壤、农艺(施肥、耕作、化学农药)等多种自然或人为因素的影响，故防病效果不佳，稳定性差^[12]。

研究发现，寡雄腐霉能产生寡雄蛋白和抗菌物质等多种次生代谢物^[6]。因此，直接利用寡雄腐霉的次生代谢产物可避免人为和环境因素对活菌生长繁殖和分泌次生代谢产物的影响，既可提高防病效果，又能克服微生物活体菌剂效果不稳定的常见缺陷。为此，本研究利用自主分离获得的寡雄腐霉优良菌株，制备发酵液，研究该发酵液对番茄植株生长的影响和对灰霉病的防治作用，并在大田生产中进行生防效果验证，旨在为研发防效好而稳定的番茄灰霉病生防制剂奠定基础。

供试番茄品种为佳粉15号；番茄灰霉病菌由西南大学植物保护学院提供；寡雄腐霉发酵菌株P. oligandrum CQ2010(Po CQ2010)从种植番茄的土壤中自主分离获得，保存于西南大学资源环境学院微生物实验室。取60 g玉米粉，80 ℃水浴2 h，过滤，滤液加15 g葡萄糖，定容至1 L，pH值调至6.0，1000 mL三角瓶装液量500 mL，灭菌得玉米汁培养液，然后接种寡雄腐霉菌株，摇床培养7 d，(30±1) ℃、150 r/min，用200 μm的滤膜真空抽滤制备寡雄腐霉发酵液，-4 ℃冰箱保存备用。预备试验中，寡雄腐霉发酵液对番茄灰霉病菌丝生长的抑制率达78.6%，对灰霉病菌的孢子萌发的抑制率达51.2%。

盆栽试验于2011年3月2日至7月10日在西南大学温室盆栽场进行。在番茄生长季节，采集重庆市典型、具有代表性的灰棕紫泥紫色土耕作层(0—20 cm)。土壤基本理化性质：质地中壤，pH值7.1，有机质10.79 g/kg，全氮0.78 g/kg，全磷0.42 g/kg，全钾20.54 g/kg，碱解氮28.34 mg/kg，有效磷10.91 mg/kg，有效钾153.2 mg/kg。将拣去石砾和植株残体等杂物的土壤晾干，高压蒸汽灭菌后备用。播种前每盆装土2.5 kg，以硝酸铵、过磷酸钙和硫酸钾作基肥，每千克土壤分别施入氮 200 mg、磷 100 mg、钾200 mg。

每盆移栽株高10 cm 左右的番茄幼苗2株，常规栽培20 d。选择60盆长势一致的番茄植株进行试验处理，每组30盆，一组接种灰霉病菌，用B.C表示；另一组不接种灰霉病菌(对照)，用CK表示。在多云无风的天气条件下：①每组各取15盆，喷施高温灭菌的培养液，以叶面上附有细密液滴但不流淌为宜，简称“培养液”，用A表示；②另15盆用寡雄腐霉发酵液喷施，简称“发酵液”，用B表示。喷施24 h后，对B.C组采用毛笔涂抹法接种灰霉病菌(孢子浓度约为1×10⁵个CFU/mL)，保湿48 h^[13]。由此形成整4个处理：①接病菌+培养液(B.C +A)；②接病菌+发酵液(B.C+B)；③不接病菌+培养液(CK +A)；④不接病菌+发酵液(CK+B)。按盆栽试验的常规方法，浇水、除草等管理番茄幼苗。

田间试验于2012年3月12日至7月10日在重庆市北碚区璧山县番茄种植基地日光温室中进行，以具有代表性的灰棕紫泥为供试土壤，田间种植当地的主栽番茄品种(约2000 株)，研究了寡雄腐霉发酵液对灰霉病的防治作用。试验设置3种处理：①寡雄腐霉发酵液(T1)；②化学农药腐霉利(T2)；③清水(CK)，施药间隔期30 d(3月至7月)，施药量800 L/hm²，每处理重复3次，每个处理小区面积38.95 m²约200株，随机区组排列，并常规管理大田番茄植株。

盆栽试验处理后35 d，收获番茄植株。先称取生物量，再随机选10个成熟功能型叶片，用打孔器取样，丙酮提取-分光光度法测定叶绿素含量^[14]，并选取新鲜须根，用TTC法测定根系活力^[14]。然后，将植株105 ℃杀青后(80±2) ℃烘干，常规分析氮、磷、钾含量^[15]。

盆栽试验中，处理后第10天调查、统计番茄植株发病率和病情指数；大田试验中，调查各个小区最后一次施药10 d后灰霉病引起的病果率，计算防治效果。番茄灰霉病的分级标准及药效计算方法按照《农药田间药效试验准则》进行^[16]。

盆栽试验处理后第1、4、7、10、13天，分别随机选取5个成熟功能型叶片，用打孔器取样，电导法测定细胞膜透性^[17]，硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量^[18]。并在第10天采集样叶，称取0.5 g，加石英砂和PBS 溶液(pH值7.8)冰浴匀浆，4 ℃、10 000 r/min离心，收集上清液。测定超氧化物歧化酶活性(SOD)和苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)^[19]；多酚氧化酶活性(PPO)^[20]。

试验数据用DPS v6.50统计软件处理，并采用LSD法检测处理间差异显著性。

图 1可见，盆栽试验中，在不接种病菌的条件下，施用寡雄腐霉发酵液显著促进番茄植株生长，总生物量提高了9.5%。其中，地上部生物量分别为34.29 g/株(对照)、36.64 g/株(发酵液)，提 高了6.9%；根系生物量分别为15.05 g/株(对照)、17.37 g/株(发酵液)，提高了15.4%。

图 1 番茄植株生物量 Fig. 1 The biomass of tomato seedlings B.C：接病菌；CK：不接病菌；A：培养液；B：发酵液，以下同; 有不同小写字母表示经LSD检验在P < 0.05水平差异显著

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从图 2中可以看出，盆栽试验中，在不接种病菌的条件下，施用发酵液的处理叶绿素含量最高为1.18 mg/g，比施用培养液的处理显著提高了21.6%，根系活力比施用培养液的处理也提高了14.4%。但是，在接种病菌的条件下，施用发酵液对叶绿素含量和根系活力没有显著影响。

图 2 番茄叶片叶绿素含量与根系活力 Fig. 2 The chlorophyll content and root activity of tomato seedlings

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由表 1可知，盆栽试验中，在不接种病菌的条件下，施用寡雄腐霉发酵液促进番茄植株吸收养分，氮、磷、钾吸收量分别增加了8.0%，12.3%，13.6%；在接种病菌的条件下，施用发酵液显著提高番茄植株吸收氮素，但对磷、钾吸收量无显著影响。

从表 2可知，盆栽试验中，在不接种病菌的处理中，番茄植株未发生灰霉病。在接种病菌的处理中，施用培养液的发病率和病情指数分别为75.7%和43.3；施用寡雄腐霉发酵液的发病率和病情指数分别为32.4%和17.2，发病率和病情指数分别降低了57.2%和60.3%，相对防治效果达到60.3%。大田试验中，施用寡雄腐霉发酵液的发病率和病情指数分别为29.8%和11.3，发病率和病情指数分别降低了59.0%和71.2%，相对防治效果达到71.2%。

图 3可见，盆栽试验中，接种病菌显著提高番茄叶片细胞膜透性，且随时间的延长而增加，其平均值分别为31.0%(接种后第4天)、40.2%(接种后第7天)、47.0%(接种后第10 天)、53.4%(接种后第13天)，但是，在不接种病原菌的处理中，叶片细胞膜透性无显著变化。值得注意的是，接种病菌后，施用发酵液显著降低叶片细胞膜透性，分别比培养液降低了24.8%(接种后第7天)、14.0%(接种后第10天)、16.6%(接种后第13天)；若不接种病原菌，在培养液和发酵液之间，叶片细胞膜透性无显著差异。

图 3 不同试验处理对番茄叶片细胞膜透性和丙二醛的影响 Fig. 3 Influence of experimental treatments on cell membrane permeability and the content of MDA in leaves of tomato seedlings

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在番茄叶片中，丙二醛含量的变化类似细胞膜透性，即接种病原菌提高叶片丙二醛含量，且随处理时间的延长而增加，施用发酵液显著降低接种病原菌叶片的丙二醛含量；相反，在不接种病原菌的处理中，叶片丙二醛含量无显著变化，施用发酵液和培养液之间无显著差异。

由表 3可知，盆栽试验中，接种病菌显著提高番茄叶片中的SOD、PPO、PAL活性，其平均值分别提高了12.9%、84.0%、36.0%。在接种病原菌的处理中，施用发酵液显著提高了PPO和PAL活性，分别提高了35.8%和41.4%，但对SOD无显著影响。在不接种病原菌的处理中，施用发酵液对SOD、PPO、PAL活性无显著影响。

一般而言，化学农药干扰动物代谢，不同程度地危害人畜健康，有些化学农药还能产生致病、致癌、致变等作用，逐步由使用化学农药过度到安全无毒的生物防治是植物病虫害防治的目标之一。目前，我国植物病虫害防治的主要手段仍然是化学药剂。几十年来，尽管做了大量的研究工作，但完全可以代替化学杀菌剂的生物农药还不多，研制高效、安全、无毒的新型生物农药很有必要。

研究发现，目前各国应用较广泛的生防菌木霉有很强的根际定殖能力，能产生多种次生代谢产物，提高叶绿素含量、促进氮和矿物元素吸收，改善植物营养；与根系微生物相互作用，抑制多种病原菌生长；诱导辣椒、马铃薯、莴苣、黄瓜、白菜、豌豆、花生、长春花和菊花等多种作物产生抗病性，具有防病促生效应^[12]。与之类似，生防菌寡雄腐霉卵孢子接种于黄瓜和胡椒根际，能改善它们的磷素营养，增加植物体内的吲哚乙酸(IAA)含量^[9]，促进植物的生长。一般而言，有益微生物促进植物生长的现象常常与微生物产生生长素和相关次级代谢物的合成具有密切联系，研究发现，寡雄腐霉产生大量色胺TNH₂，当寡雄腐霉在培养基中生长的时候，还有一些植物生长素前体，包括色氨酸Trp和吲哚乙酸IAAld，都表明寡雄腐霉产生色胺类生长素复合物^[21]。此外，寡雄腐霉还能分泌抗菌物质^[10]、拟激发子蛋白^[21]、类毒素物质色胺等^[22]，它们细胞壁中的蟹壳素、葡聚糖、细胞壁蛋白等，都能保护和诱导多种蔬菜产生系统抗病性^[11]，如诱导小麦、甜菜、番茄对丝核菌R. solani AG2-2、番茄枯萎病(F. oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)和灰葡萄孢(B. cinerea)的抗性反应^[23]。研究还发现，液体培养寡雄腐霉菌丝，匀浆后也能诱导番茄对青枯菌的抗性^[24]。据报道，施用寡雄腐霉卵孢子防病效果介于0—74.5%之间，促进生长的作用也不甚稳定^[11]，进一步提高其防效很有必要。在本试验中，利用寡雄腐霉优良菌株制备内含次生代谢产物、具有生防作用的发酵液，喷施健康和感病的番茄植株。结果表明，健康植株施用寡雄腐霉发酵液后，叶绿素含量和根系活力提高，有益于增强光合作用，增加氮、磷、钾养分吸收，促进植株生长；感病植株施用寡雄腐霉发酵液后，有效降低了番茄灰霉病的发病率和病情指数。因此，寡雄腐霉发酵液不仅可以稳定有效的防治番茄灰霉病，还能促进番茄植株的生长，与生防菌木霉等有相同的生物学效应。

植物受到病原菌侵染时会产生大量的活性氧，多余的活性氧会影响植物的正常生理活动，膜脂过氧化形成丙二醛等过氧化产物，从而不同程度地破坏细胞膜的完整性，膜透性增加、选择透性降低、胞内电解质外渗，环境介质的电导率增加^[25]。番茄植株接种灰霉病菌后，膜透性和丙二醛含量增加，但施用发酵液降低细胞膜透性和丙二醛含量，说明寡雄腐霉发酵液中的次生代谢产物直接或间接地增强了植株抗性或减轻了灰霉病对番茄植株细胞膜等造成的伤害。

在病原菌、生防菌、植株三者相互作用过程中，生防菌可作为植物激活剂，诱导植物系统获得抗病性(ISR)，与病原物诱导的植物系统获得抗性(SAR)基本类似。ISR的作用机制主要是通过组织木质化，增强细胞机械屏障和产生植保素，它们涉及到苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)与超氧化物歧化酶(SOD)等催化的生物化学过程，对于抵抗真菌、细菌和病毒，保护植物免受疫病危害，促进作物生长，弥补损失，减轻病害程度有重要作用^[26]。在病原菌诱导防御反应研究中，有研究曾报道，番茄植株对细菌性溃疡病Pseudomonas syringae的抵抗力与PPO活性呈显著正相关，抗性强的品种PPO活性显著高于敏感品种^[27]。PAL和POD的活性与串珠镰刀菌引起玉米对穗粒腐病抗性呈负相关，而与丙二醛含量的变化呈正相关^[28]。在生防菌次生代谢产物提高植物抗病能力的研究中，李颂等也研究发现，施用黑曲霉次生代谢产物，可显著提高番茄植株体内SOD、PPO、PAL等防御性相关酶的活性^[30]；在海洋芽孢杆菌B-9987的无细胞滤液中，所含的活性物质对茄链格孢菌和灰葡萄孢具有良好的生防作用^[30]。在本试验中，番茄植株接种灰霉病菌后，SOD、PPO和PAL活性提高，施用寡雄腐霉发酵液进一步提高了SOD、PPO和PAL活性，说明灰霉病菌能诱导番茄植株产生抗性反应，寡雄腐霉发酵液同样也能提高保护酶和防御酶的活性，促进合成抗性物质，构成保护性屏障，协同抗病，从而提高番茄植株的抗病能力，防止病原菌入侵，减轻病原菌产生的伤害作用。

总之，寡雄腐霉发酵液不仅能有效防治番茄灰霉病，而且还具有促进番茄生长的作用，显著不同于只具有防病治病作用的生防制剂，进一步开展深入研究，可望制备出高效、稳定、安全兼具防病促生的生物农药。