随着经济的不断发展，工业废渣、农业、生活废弃物的排放导致土壤生态环境受到严重破坏，其中重金属污染尤其值得重视^[1]。土壤重金属来源主要包括矿山开采、金属冶炼、三废排放及农药杀虫剂的广泛使用等，据统计我国因采矿造成土壤重金属污染的面积已达1.5×10⁶hm²，同时每年还以4.67×10⁴hm²的速度增长^[2]。因此，修复重金属污染土壤已成为刻不容缓的现实需要和亟需解决的科学问题。植物修复技术因其对环境友好、修复成本低、效果好等优点而受到研究者的广泛关注^[3]。以往的研究大多集中在超积累植物方面，并取得了丰富的研究成果，但大多数超积累(富集)植物因其生物量小、生长速度慢、对复合重金属污染土壤修复效果差而在实际应用中受到限制^[4]，因此寻找对重金属有富集特性且生物量大、生长速度快的植物就显得极为重要。

毛竹是我国栽培面积最广的竹类资源，占我国竹林资源的70%，其地域适应性强，广泛分布在北纬46°以南地区，可生长在海拔4000m地区^{[5, 6]}，毛竹林生物量可达116.5t/hm^2[7]。毛竹具有独特的生长特性，能在幼笋出土的短短两个月内完成秆形生长，最高可达15m^[5]。同时本课题组通过前期对衢州铅锌尾矿的生境调研发现，在矿区周围分布有成片的毛竹林^[8]，这表明其对重金属具有很强的耐性，具备作为修复材料的前提条件。本文从毛竹修复重金属污染土壤角度出发，研究重金属胁迫下毛竹种子的萌发特性及在重金属胁迫下的生长和吸收特征，为毛竹修复重金属污染土壤提供理论依据和技术支撑。

供试验毛竹种子2012年9月购自于广西桂林，储存于4℃冰箱，种子净度99.2%，千粒平均质量为28.16g，种子平均含水率为12.1%。Pb²⁺、 Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺的供源分别为Pb(NO₃)₂、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O 、CdCl₂，均为分析纯试剂。

选取大小均匀，健康饱满的毛竹种子，经2g/L高锰酸钾溶液表面消毒30min，并在室温(25.0℃)中用蒸馏水浸泡24h，再将种子放置于25℃恒温箱中，用不同Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺浓度溶液浸泡48h后进行发芽处理。4种重金属设置10种浓度处理分别为0(CK)、10、25、50、100、200、400、800、1600、2400μmol/L，其中0(CK) μmol/L为对照浓度。

将处理后的种子整齐排列在铺有双层滤纸的培养皿中，放置在25℃恒温箱中培养，并用胶头滴管添加适量的不同浓度重金属溶液，使滤纸完全湿润，同时每天在固定时刻观察记录发芽种子数，用移液枪统一补充1—2mL重金属溶液。在第5天统计发芽势，第10天统计发芽率，并测定所有萌发种子的根长、芽长、鲜重，并计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标。每个培养皿放置25粒种子，4个重复。

发芽指标测定参照李伟成等方法^[9]。

发芽率(Gr) = (∑Gt/NT)×100%

发芽势(Ge)=7d内发芽种子粒数/NT

发芽指数(Gi)=(∑Gt/Dt)

活力指数(Vi)=S×∑(Gt /Dt)

发芽抑制率= (对照组发芽率－处理组发芽率)/对照组发芽率×100%

根伸长抑制率= (对照组根长－处理组根长)/对照组根长×100%

芽伸长抑制率= (对照组芽长－处理组芽长)/对照组芽长×100%

对各浓度处理组选取5个平均长势的根系对其进行根系形态扫描。根系形态的分析指标包括根尖数、根表面积、根体积、根系总长等。本试验采用Epson Expression 10000XL图像扫描系统结合Win-RHIZO根系分析软件对以上指标进行分析。

取长势相似的10株发芽的种子进行重金属含量测定，测定地上部和根的重金属含量。测定步骤：将洗净的地上部与根105℃杀青半小时，65℃烘干至恒重并粉碎，用优级纯浓硝酸在135℃电炉中消煮，消煮完全后用超纯水定容，采用美国PE公司ICP-OES7000DV电感耦合等离子体发射光谱仪，测定重金属含量。

转移系数=地上部重金属含量/根重金属含量

采用Excel 2007做图，利用SPSS21.0进行数据计算及相关性分析。

Zn²⁺、Cu²⁺和Pb²⁺、Cd²⁺分别作为植物的必需和非必需元素，对毛竹种子的萌发有着显著的差异性。就发芽率而言，由表 1可以看出在Pb²⁺和Cd²⁺胁迫下，随着重金属浓度的升高发芽率逐渐降低，而Zn²⁺和Cu²⁺则表现出“低促高抑”的现象。在低浓度处理下，Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺ 3种元素处理对种子萌发率无显著差异(P>0.05)。Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺ 4种元素胁迫下种子发芽率最高分别为69.33%、69.33%、68%、65.33%，同CK相比发芽率波动幅度最大值分别为18.67%、16%、10.66%、72%，在浓度为2400μmol/L时，发芽率仅为5.33%，而同一浓度下Pb²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺的发芽率分别为60%、49.33%、50.67%，存在显著性差异(P<0.05)，可见Cd²⁺对毛竹种子萌发的影响最大。当浓度超过800μmol/L，Cd²⁺对种子的萌发产生严重的抑制效果。从发芽势和活力指数看，表现出同发芽率类似的规律性，同时可以发现Pb²⁺和Zn²⁺胁迫下毛竹种子的发芽指数整体上高于Cu²⁺和Cd²⁺的胁迫。活力指数是种子萌发质量的指标，综合了种子发芽速率和生长量，因此能更好的表征重金属胁迫下对毛竹种子萌发的影响。在Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺ 3种重金属元素胁迫下，种子活力指数随着重金属浓度的升高而降低，Zn²⁺则呈先升高后降低的趋势。当Cu²⁺、Cd²⁺浓度超过200μmol/L，Pb²⁺浓度超过400μmol/L后无法获得活力指数数据，其原因在于超过此浓度已无法测定根长，说明在此浓度下根的生长已经完全受到重金属的抑制，而Zn²⁺则在2400μmol/L还能测定根长，表明Zn²⁺对毛竹种子根的发育抑制作用最弱。在同一浓度下不同重金属胁迫下种子活力指数表现不一，具体表现为Zn²⁺>Pb²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺。

通过对种子萌发指标的测定表明了Zn²⁺对毛竹种子萌发的抑制作用最弱，Cd²⁺则表现出最强的抑制效果，当重金属超过一定浓度时会出现一个种子活力指数显著降低的界线，如Pb²⁺和Zn²⁺在400μmol/L时活力指数分别为前一浓度的38.7%、44.93%，而Cu²⁺和Cd²⁺在25μmol/L时出现。

对于不同类型重金属的胁迫，毛竹幼苗生长表现出截然不同的响应，但随着浓度的升高都出现毒害响应。由实验观察可知，重金属对芽的胁迫程度明显大于对根的胁迫，当Cu²⁺、Cd²⁺ 浓度在400μmol/L、Pb²⁺处理组浓度在800μmol/L时已无法测定幼苗根长，此时已出现“无根苗”现象；而对于芽长则当Cu²⁺、Cd²⁺浓度为1600μmol/L时已无法测得长度，Pb²⁺和Zn²⁺在2400μmol/L时还能测定其芽长。芽长与根长抑制率的回归方程表明，重金属浓度与抑制率呈正相关，但与根长的相关性较差，原因在于高浓度下各浓度间抑制率较为接近。图 1中可见，在Pb²⁺、Zn²⁺胁迫下，毛竹幼苗芽长表现出低浓度下促进芽伸长的规律，而Cu²⁺、Cd²⁺则为抑制；在高浓度重金属胁迫下根长与芽长的抑制效果较为明显，尤其是对根的胁迫，4种元素中Zn²⁺对芽长的抑制最弱(图 1)。

图 1 重金属胁迫下毛竹种子根与芽伸长抑制率与重金属浓度间关系 Fig. 1 Relationships between inhibition rate of bamboo seed germination and the concentration of heavy metals on root and shoot 抑制率选取根长与芽长的平均值计算

图选项

种子萌发后根系直接与重金属溶液接触，其最先受到毒害，因此通过对幼苗根系形态的观察，可直接反映出重金属对幼苗的毒害程度。由图 2可知，Cu²⁺、Cd²⁺对幼苗根长的抑制作用最显著，当浓度为25μmol/L时，根长仅为CK的37.4%、49.2%，而此浓度下Pb²⁺和Zn²⁺对根长的抑制效果却不显著；当Zn²⁺浓度小于50μmol/L、Pb²⁺浓度小于100μmol/L的处理组与CK比差异不显著(P>0.05)，且在此范围内Pb²⁺对幼苗的根伸长有促进作用，但在高浓度处理下则表现为抑制效果。Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺处理下幼苗根长的抑制程度随着金属浓度的增高而加强。图 2可见，低浓度Pb²⁺胁迫下促进幼苗根表面积的增加，当Pb²⁺浓度为10μmol/L时，根总表面积为13.40cm²，为各处理组最大值，Pb²⁺胁迫下对幼苗根表面积的影响表现为“低促高抑”，对比Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺对根面积的抑制效果可知，Zn²⁺对幼苗根表面积的发育抑制效果较为缓和，Cu²⁺则表现出明显的抑制

图 2 重金属胁迫对毛竹根系形态影响 Fig. 2 Effects of heavy metal on root morphology of bamboo

图选项

效果，浓度为200μmol/L时仅为CK的27.2%。图 2C可见，在同一浓度范围内(10—200μmol/L)Pb²⁺胁迫下根体积变化幅度最小而Cd²⁺变化幅度最大，说明在这个范围内Pb²⁺对根体积抑制作用较弱，Cd²⁺则表现出明显的抑制作用，而Zn²⁺却表现出一定的促进效果。对于根尖数的影响，Pb²⁺和Zn²⁺整体上同样呈现出“低促高抑”的趋势，而Cu²⁺和Cd²⁺则随着浓度的增加而减少，当浓度为25μmol/L时，Cu²⁺出现一个明显的变化，根尖数迅速降低，仅为前一浓度的40.5%。

通过扫描根系形态，发现必需元素(Cu²⁺和Zn²⁺)与非必需元素(Pb²⁺和Cd²⁺)对毛竹幼苗的抑制作用差异明显，低浓度处理下Cu²⁺和Cd²⁺对幼苗生长的抑制作用强于Pb²⁺和Zn²⁺，但对于高浓度重金属胁迫下，其抑制效果相差不大。

毛竹在重金属处理下地上部与根的重金属含量见表 3，表中根系干物质量均选择大于0.01g。随处理水平的增加地上部的重金属含量增加(Cd²⁺除外)，幼苗地上部对Pb²⁺的吸收能力强于其余3种重金属，最高浓度可达6810.51mg/kg，对Cd²⁺的吸收能力最弱，在400μmol/L时吸收能力达到最高，地上部含量为429.33 mg/kg；当浓度大于800μmol/L时，Cu²⁺、Cd²⁺胁迫下毛竹种子地上部的发育完全受到抑制，可能是由于高浓度的金属离子超过了毛竹幼苗的忍耐能力，降低细胞活性，抑制了芽的发育。相关性分析表明，在低浓度处理下Pb²⁺(10—400μmol/L)、Zn²⁺(10—25μmol/L)、Cu²⁺(10—200μmol/L)、Cd²⁺(10—50μmol/L)处理组地上部含量差异不显著，同时发现在高浓度Zn²⁺(1600、2400μmol/L)处理间差异不显著，可能原因是高浓度的Zn²⁺抑制了幼苗体内细胞的活性，降低对Zn²⁺的转运能力。对于根吸收而言，幼苗根对Zn²⁺有较强的忍耐能力，当Zn处理浓度达到2400μmol/L处理时种子还能长出根，对Pb²⁺耐性次之，当浓度超过400μmol/L后则抑制了根的发育，对Cd²⁺、Cu²⁺的耐性最弱，当浓度超过200μmol/L时就已完全抑制根的生成。对比根和地上部的重金属含量，在同一浓度处理下，根含量明显高于地上部的含量，Pb²⁺处理下随着重金属浓度的增加其由根部转运至地上部的能力减弱，当浓度达 到400μmol/L时根重金属含量是地上部的17.22倍，达到最大，对于Pb²⁺较低的转运能力，其原因可能是由于Pb²⁺的毒害作用，对植物细胞膜结构造成损伤，扩大根细胞质膜的透性，使植物以非正常生理代谢方式被动吸收Pb²⁺，导致大量Pb²⁺累积于根部细胞，同时在根系细胞中其存在形式主要以PbCO₃、Pb(PO₄)₂等沉淀形式或者络合态存在，抑制了Pb²⁺向地上部运输^[10]；而幼苗对Zn²⁺的转运能力强于其他3种重金属，最高浓度400μmol/L处理下根与地上部重金属含量仅相差4.6倍；整体上毛竹对重金属转运能力强弱顺序为Zn²⁺>Cd²⁺>Pb²⁺>Cu²⁺。

当前已有少数学者对重金属胁迫下不同竹子的生理响应进行研究，但仅针对竹类中的少数品种，如随着铜浓度的增加，Phyllostachys Auresulcata (Spectabilis) 及Pleioblastus Chino (Hisauchii)两竹种体内MDA含量上升而抑制了叶绿素的合成和植株的光合作用，Pleioblastus Chino (Hisauchii)体内铜含量可达2000mg/kg^[11]；王兵等对鹅毛竹的研究中同样证实了重金属胁迫提升了鹅毛竹体内MDA含量，抑制了叶绿素的合成，同时也增加了细胞膜的通透性^[12]；Collin等的水培试验证实了Gigantocloa sp. “Malay Dwarf ”对铜具有很高的耐性^[13]。在铅胁迫的研究中，菲白竹体内的矿质营养平衡被破坏，尤其是Na^＋/K^＋的平衡被打破是铅毒害的主要原因，其体内铅含量可达8211mg/kg^[14]。而种子萌发和幼苗生长期是植物对环境胁迫较为敏感的时期^[15]，因此通过研究种子在胁迫条件下其萌发与幼苗生长的特征可以在一定程度上反映植物对胁迫的耐性^[16]。Pb²⁺、Cd²⁺作为植物生长的非必需元素，通过根系吸收在植物体内积累，抑制种子萌发，同时破坏细胞结构，降低植物光合作用，从而影响植物的生长发育^[17]。Cu²⁺、Zn²⁺作为植物的必需元素，在一定浓度范围内会对植物产生有益的作用，即在低浓度下产生促进作用，但超过某个浓度范围则直接危害植株的生长发育^{[18, 19]}。

在本实验中，毛竹种子萌发结果在四种重金属不同浓度胁迫下表现出极大差异性，Zn²⁺对种子萌发的影响最弱，而Cd²⁺的抑制作用最强，同时发现在部分高浓度处理下种子分萌发率高于低浓度的处理，其可能原因在于重金属的毒性不同及与毛竹种子的质量密切相关，种子的萌发率只是其中一个反应重金属胁迫的影响因素，代表性不强，而活力指数则是综合表现了重金属胁迫对种子萌发的影响，因而更具有代表性。从整体角度而言，在Pb²⁺、Cd²⁺的胁迫下毛竹种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数等各项指标随着重金属浓度的升高而降低，Cu²⁺、Zn²⁺胁迫下毛竹种子的发芽率、发芽势、发芽指数都呈现随重金属浓度增加出现先增加后减小的规律，但低浓度处理之间差异不显著(P>0.05)，而两者的活力指数则表现出不同的结果，表明Cu²⁺对种子的毒性强于Zn²⁺对种子的毒性。这与金丝草^[20]、龙葵^[21]、海州香薷^[22]、高羊茅^[23]等种子萌发结果类似。

杜天庆^[24]等对小麦的研究中发现，重金属对幼苗根的毒害明显强于对芽的毒害。可能主要原因在于植物根系直接与重金属环境接触，同地上部比较根系最先受到重金属的毒害，同时在根部细胞壁上存在着能够大量固定重金属离子的交换位点，当重金属被根尖吸收后诱发其产生自由基，当自由基超过植物自身抗氧化系统酶的清除能力时，多余的自由基会伤害根系代谢中的琥珀酸脱氢酶等，使根系活力下降，从而抑制了重金属由根系上地上部转移^{[25, 26]}。在重金属胁迫下，毛竹幼苗的生长表现出同样的现象，重金属明显抑制了根的发育，对芽的抑制程度较小，因而出现“无根苗”现象。对于不同重金属胁迫，其根系变化规律各异：Pb²⁺胁迫下除了对根体积的产生抑制效果外，对总根长、根总表面积及根尖数在低浓度处理下有促进作用，而在高浓度处理则明显的抑制；Zn²⁺胁迫则抑制了根总表面积而对根体积和根尖数呈现“低促高抑”现象，对总根长则抑制效果不明显；Cu²⁺、Cd²⁺则完全对根长、根总表面积、根体积及根尖数产生抑制效果。

在不同重金属胁迫下，植物对各重金属元素具有不同的耐性机制。Cu²⁺、Zn²⁺作为植物生长必需的营养元素，但在植物体内却表现出极大的差异性。Cu²⁺在50μmol/L时，根铜浓度只有391.19mg/kg，而Zn²⁺在同等条件下却能达到789.76 mg/kg，同CK相比净增加547.15 mg/kg，而铜浓度只提高了353.79 mg/kg，同时对重金属的转移系数Cu²⁺只有0.15，Zn达到了0.21；当浓度超过200μmol/L后Cu²⁺已无法测定其根长，而Zn²⁺在2400μmol/L浓度下还可测定根长，但Cu²⁺浓度超过50μmol/L、Zn²⁺浓度超过400μmol/L后根干物质量已小于0.01g，这表明在Cu²⁺、Zn²⁺两重金属胁迫下，Cu²⁺的毒性明显大于Zn²⁺。同Pb超积累植物土荆芥^[27]、Zn超积累植物东南景天^[28]、Cd超积累植物宝山堇菜^[29]、Cu超积累植物海州香薷^[30]相比，其体内重金属含量相对较低，重金属的转移系数也小于1，但从生物量角度比较，毛竹每公顷生物量可达116.5t^[7]，远远高于超积累植物。因此综合考虑各种因素，利用毛竹修复重金属污染土壤具有很大的潜力。在幼苗重金属含量的研究中发现，其地上部Pb的含量远高于其他3种元素，原因可能由于不同重金属对植物毒害的差异性导致幼苗吸收、转运的不同，因此地上部含量产生差别，同时在重金属胁迫下出现“无根苗”现象，如Pb²⁺浓度大于400μmol/L及Cu²⁺与Cd²⁺ 浓度大于200μmol/L处理下，种子仅萌发出胚根，芽通过胚根直接与重金属溶液接触，同时胚根吸收的重金属离子也直接被转移到地上部，导致地上部重金属含量显著升高，而Zn则由于根的存在，抑制了Zn²⁺向地上部转运。

从整体上来看，4种金属对毛竹种子的萌发以抑制作用为主，随着重金属浓度的升高幼苗体内重金属含量也增大。其中Cd²⁺对毛竹种子萌发及幼苗生长的毒害最用最强，Cu²⁺次之，Pb²⁺和Zn²⁺最弱，对重金属的转移能力却表现出Zn²⁺>Cd²⁺>Pb²⁺>Cu²⁺，说明毛竹对Pb²⁺、Zn²⁺有很好的耐性，但对Cd²⁺的吸收转运能力更强。

综上，本文系统揭示了毛竹种子在重金属胁迫下的萌发和富集情况，为将毛竹作为植物修复材料加以研究做了初步的探索。今后，随着研究的不断深入，有必要从生理层面对毛竹的重金属耐性进行深入研究，探讨重金属在毛竹体内的转移机制，研究毛竹对重金属的解毒机理，这对于今后进一步丰富植物修复技术手段具有重要的研究价值和实用意义。