水库是一种介于河流和湖泊间的半人工半自然水体，其生态系统直接受到人类活动调节，具有独特的生态学特征^[1]。近十多年来，由于地下水不足和河流污染日趋严重，远离大城市的水库逐渐成为重要的饮用水水源，且呈逐年增加的趋势。水库生态系统关系到居民饮水健康、社会稳定、以及经济的可持续发展^{[2, 3]}，特别是担负着城市饮用水安全的水库需要更多的监测、评估和研究。生态系统的多样性和可持续性一直是水环境保护研究的重点^[4]。浮游细菌具有分布广泛，代谢快，对环境变化反应迅速等优点^[5]，且与水体质量特别是水体富营养化密切相关，因此受到越来越多的关注和研究^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}。水体理化指标，如水温、溶解氧、营养盐等是生命活动的基础，也是水生态系统的基本参数^{[12, 13, 14]}。因此，研究水库水体浮游细菌多样性及其影响因子有利于提高对水库生态系统的认知水平^[15]，可为水库的评估和管理提供基础资料和科学依据。以往对水库型水源地的研究侧重于水平尺度评价水库生态系统的时空变化，而对我国亚热带热分层水库细菌群落结构特征与变化的研究还远远不够^[2]。典型热分层水库随着水体温度分层的出现，其他物理化学参数也呈现梯度变化，使得不同水层的生境特征差异显著，这为研究水体浮游细菌的垂直分布规律提供了良好的实验材料。

东圳水库是典型亚热带分层水库，位于海峡西岸地区福建省木兰溪支流延寿溪上，是莆田市唯一一座已建成大型水库。该水库于1960年建成，主要用途为灌溉、防洪、发电及生活和工业用水，水库流域面积321 km²，总库容4.35亿m³，水域面积达17.7 km²，设计正常蓄水位80.5 m，相应库容2.83亿m³，库区多年平均径流量3.02亿m^3[16]。

本研究以水体温度、溶解氧和叶绿素a垂直变化特征为依据对东圳水库进行分层采样，区别于只研究表层或混合水样的传统方式。通过在水体表层-好氧区-缺氧区的分层采样，利用PCR-DGGE和克隆测序的方法，研究不同水层细菌群落组成与多样性；结合采样现场和实验室测定的十项理化指标，分析细菌群落与水体理化指标特别是氮磷营养元素之间的定量关系，进而为水库型水源地水质优化管理与饮用水安全保障提供科学资料。

2011年10月选择东圳水库坝前湖泊区进行垂直分层采样(图 1)。采样站最大水深为36 m，现场以1 m为间隔测定温度、溶解氧和叶绿素a浓度，并绘制相应的垂直变化曲线，据此确定采样深度。本研究共选择采集5个水层的样品：0号样品采集于表层水体；10号、20号样品采集于温跃层以上，属于溶解氧含量较高的好氧区，其对应的水深分别是10 m和20 m；26号、33号样品采集于温跃层以下，属于溶解氧含量低的缺氧区，对应水深分别是26 m和33 m。每个采样深度取5 L水，并快速运送至实验室进行分析。

图 1 东圳水库采样点示意图 Fig. 1 Sampling location in Dongzhen Reservoir

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本研究分析测定的环境参数通过现场测定和实验室测定完成。现场测定采用HACH多参数水质测量仪进行，包括温度、电导率、pH、溶解氧和叶绿素a；总氮、氨氮、硝氮、总磷及磷酸盐的测定，则依据国家环保部的标准方法在实验室进行^[17]。

将水样摇匀后取1 L，经0.22 μm微孔滤膜过滤，将载有细菌的滤膜保存于-80℃冰箱。取出冰箱中的滤膜，在超净工作台中用灭菌的剪刀将其剪碎，装入灭菌离心管中，按照试剂盒说明书(E.Z.N.A^TM Soil DNA Kit，Omega Bio-Tek，USA)进行DNA提取，DNA提纯后重悬于80 μL缓冲液中。提取的DNA样品分装于小管中，置于-20℃冰箱中保存备用。

为研究细菌群落，选择16S rDNA通用引物341F(5′-GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和907R(5′- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3′)作为PCR扩增引物，其中引物341F 的5′末端加上结构为5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC-3′ 的GC链^[18]。PCR反应体系为50 μL，包括5 μL 10 × Ex PCR缓冲液(10 mmol/L，Mg²⁺终浓度为1.5 mmol/L)，4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 μL Ex Taq酶(5 U/μL)，PCR前后引物各1 μL(10 μmol/L)，36.5 μL ddH₂O和2 μL DNA模板。PCR反应程序如下：预变性条件为94℃，5 min；35个循环为94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。

使用美国Bio-Rad公司的Dcode Universal Mutation Detection System 电泳系统进行变性梯度凝胶电泳。本实验中采用浓度为6%的聚丙烯酰胺，变性剂梯度为35%—55%。电泳缓冲液为1 × TAE，电泳运行设置：恒温60℃，恒压100 V，电泳16 h。电泳完毕后，使用SYBR Green I染液染色30 min，经ddH₂O冲洗后，在Gel Doc EQ imager(Bio-Rad，USA)成像系统下扫描拍照。

从DGGE凝胶上切下清晰、明亮的条带，置于50 μL ddH₂O中4℃过夜。以溶出的DNA作为模板，341F/907R为引物进行PCR扩增，反应条件同1.3。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体，随后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中孵育、培养并进行蓝白斑筛选。挑取白色克隆进行PCR检测，将正确插入目的片段的克隆样品进行测序分析。序列在NCBI数据库(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行比对，查找与其最相似的已知序列以确定其分类归属。

利用Quantity One软件对DGGE图谱上的条带进行数字化处理。以每个泳道上条带有无为标准构建0/1矩阵。利用PRIMER 5.0软件计算细菌群落物种丰度(条带数，S)和多样性指数(Shannon-Wiener指数，H′)；基于Bray-Curtis系数计算各采样水层间细菌群落组成的相似系数，并进行聚类分析^[19]。

利用CANOCO 4.5软件分析细菌群落与环境因子之间的定量关系。为了显示环境变量的梯度变化，采用主成分分析(PCA)对理化指标进行分析,除pH外的其他参数均经过ln(x+1)转换。细菌群落数据的除趋势对应分析(DCA)结果显示最大的梯度长度小于3，表明符合线性分布，适合采用冗余分析(RDA)来分析细菌群落与环境因子之间的关系。

本研究获得的细菌16S rDNA序列在GenBank的登录号为：KC282459-KC282465。

本研究中，采样站点最大水深为36 m。现场测定结果显示，水体的温跃层在水深23—26 m处，温度由23.44℃骤降至17.03℃；溶解氧急剧变化区在水深23—24 m处，其含量由3.96 mg/L降至0.24 mg/L，水深24 m以下为缺氧区；叶绿素a含量表现为：0—5 m表层水体中，随着水深增加而增加，水深10—15 m含量有所下降，15—21 m波动上升，而后在温跃层快速下降至0.2 μg/L左右，并保持平衡；其他指标随水深亦呈梯度变化，且在温跃层表现最为显著。东圳水库5个采样水层水体理化参数见表 1。总氮、氨氮、硝氮显示出较明显的规律性，随着水深增加，总氮及氨氮含量逐渐增加；硝氮含量则在好氧区0—20 m内的水深较稳定，20—26 m间有一定下降，此后随着水深增加，呈逐渐降低趋势。

主成分分析(PCA)结果显示，PCA前两轴累计贡献率为95.8%，其中第一轴贡献率为91.2%，综合了绝大多数信息。对PCA第一轴贡献率大的因子分别是：温度(r=-0.9979)、溶解氧(r=-0.9900)、电导率(r=0.9732)、硝氮(r=-0.9571)、氨氮(r=0.9423)、叶绿素a(r=-0.9004)、总氮(r=0.8693)；而对第二轴贡献率较大的是总磷(r=0.5051)。沿PCA第一轴，5个采样水层可大致分为2组，第1组包括0 m、10 m和20 m样品，属于上层温度较高的好氧区；第2组为26 m和33 m样品，属于下层低温的缺氧区(图 2)。

图 2 东圳水库环境因子主成分分析(圆点表示采样点，数字表示采样深度) Fig. 2 PCA plots of environmental variables from water samples at different depths in Dongzhen Reservoir(Black dots and numbers indicate sampling sites and their water depths,respectively)

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DGGE指纹图谱(图 3)共显示出45个不同的条带，其中19个条带在5个样品中均有出现，占总条带数的42%；8个条带为单个水层特有，占总条带数的18%，其中2个条带仅在0 m出现，1个条带仅在10 m出现，3个条带仅在26 m出现，而2个条带仅在33 m水层处出现。5个采样水层的DGGE条带数平均值为30.6，其中，20 m处最低，为25；26 m处最高，为38。Shannon-Wiener指数均值3.409，20 m水层最小，为3.219；26 m水层最大，为3.638。DGGE条带数和Shannon-Wiener指数均呈现底层(26—33 m)显著高于表层(0-20 m)的特征(图 4)。

图 3 16S rDNA的DGGE指纹图谱及切胶示意图 Fig. 3 The 16S rDNA fingerprinting of bacterial communities by PCR-DGGE. Bands indicated with an arrow head were excised and sequenced

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图 4 东圳水库细菌群落DGGE条带数和Shannon-Wiener指数垂直分布 Fig. 4 Vertical distribution of DGGE band number and Shannon-Wiener index of bacterial community in Dongzhen Reservoir

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基于Bray-Curtis相似性系数的聚类分析中，当相似度为74.0%时，5个水层被划分为两组：第1组由上层温度较高，硝氮含量较高的好氧区水体0、10 m和20 m样品组成；第2组是由底层温度较低，氨氮含量较高的缺氧区样品组成，即26 m和33 m样品(图 5)。

图 5 东圳水库细菌群落聚类分析 Fig. 5 Cluster analysis of bacterial community based on Bray-Curtis similarity in Dongzhen Reservoir

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对DGGE优势条带测序分析，成功获得7条序列(图 3,表 2)，均为5个采样水层所共有。同NCBI数据库比对分析发现，绝大多数与不可培养的细菌序列相似性较高。系统发育分析表明，其中4条序列属于β-变形菌(Betaproteobacteria)，1条序列属于α-变形菌(Alphaproteobacteria)，2条序列属于放线菌(Actinobacteria)。

冗余分析(RDA)结果显示，10个环境因子共同解释了74.3%的细菌群落组成变化，仅溶解氧与第一排序轴呈显著的相关关系(P < 0.01)，其余9个环境因子与细菌群落相关性不显著(图 6)。在RDA的前4个排序轴中，第一轴的特征值最大(0.576)，因此，环境因子沿第一轴的变化对浮游细菌的分布影响最大，而且溶解氧是最显著的环境因子。沿第一轴，上层好氧区水体0 m、10 m和20 m位于RDA双序图左侧，而底层缺氧区26 m和33 m位于右侧。

图 6 东圳水库细菌群落与环境因子的RDA排序图 Fig. 6 RDA ordination showing the bacterial community composition in Dongzhen Reservoir in relation to the environmental factors **表示P < 0.01

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深水湖泊与水库的水环境和水体季节性热分层紧密联系^{[20, 21]}。典型的亚热带深水水库中，夏秋季节上层水体温度明显高于下层水体，由于水体的热能传输不均匀，冷、热水体密度的差异导致水体的物理分层，进而导致不同水层之间化学性质也产生差异，同时表现在水体溶解氧在温跃层的剧烈变化。东圳水库位于亚热带季风气候区，水温常年在15℃以上，本次秋季采样研究中，表层水温为23.90℃，底层水温为15.06℃，在水深23—26 m处，水温由23.44℃骤降至17.03℃。因此，上层水体温度较高，浮游植物光合作用加强，产生的氧气释放到水体，使上层水体溶解氧浓度升高，甚至过饱和；而在下层水体中，则可能发生与此相反的过程，在下层水体和沉积物中的细菌分解有机质以及浮游生物遗体等，消耗水体中溶解氧，致使溶解氧浓度下降，进而形成缺氧环境。而热分层结构的形成和维持稳定限制了水体的垂直交换，其强度足以阻断上层水体向下层水体的耗氧补偿^[22]。这也从本研究中上、下层水体溶解氧的显著变化得到了印证，在水深23—24 m处，溶解氧由3.96 mg/L降至0.24 mg/L，由好氧环境跃变为缺氧环境。此外，综合环境变量的主成分分析(PCA)结果也证明，东圳水库水体热分层使上下不同水层具有多样的水环境，这势必将影响水库内水化学(如氧化-还原变化)、物质地球化学循环，甚至导致水体浮游生物群落结构在不同水层之间存在显著的差异^[20]。

水体的季节性热分层对湖泊水库氮、磷等营养元素的循环转化过程都起着关键性控制或影响作用^{[23, 24]}。东圳水库的研究表明，随着水深的增加，总氮和氨氮的含量呈升高趋势，而硝氮的含量在好氧区比较稳定，在缺氧区显著降低，预示着在缺氧区，可能存在强烈的反硝化作用，将硝态氮还原。磷酸盐则呈现交替变化现象，总的趋势是底层缺氧区磷酸盐含量要高于上层好氧区，这也支持Carpenter的研究模型^[21]。大型湖泊或者水库底部有大量富含磷酸盐的沉积物，在氧化环境下沉积物/水界面形成的铁、锰氧化物会吸附、沉淀可溶性磷酸盐，进而降低磷的释放量^{[25, 26]}；但当底层水体含氧量低时，铁、锰和其他重金属元素被还原^[27]，磷酸盐释放进入水体导致水体富营水平升高。来自沉积物的内源磷释放也很好的解释了当外源的磷被有效控制后，水体富营养化状态并没有立即得到改善^{[28, 29]}。

细菌不仅是水生态系统中的生产者而且也是主要的分解者，在有机质分解矿化和生态系统物质循环中发挥必不可少的关键作用^{[30, 31]}。热分层水体的物理化学分层直接导致上下水层细菌群落结构的差异，其中，溶解氧与细菌群落结构显著相关(图 6)。东圳水库秋季细菌群落存在明显的垂直分层现象，5个水层被分成两组，即上层好氧区和下层缺氧区。下层缺氧区细菌多样性指数和DGGE条带数显著高于上层好氧区。合理的解释是，上层死亡的生物体和碎屑沉降到下层水体中，为分解者提供了良好的食物来源，而绝大多数分解者为细菌，故下层缺氧区细菌DGGE条带数和多样性指数较高。也有研究显示，溶解氧的降低可能为一些专性或兼性厌氧细菌创造了良好的条件，导致水体浮游细菌多样性的增多^[32]。此外，在氮循环过程中，好氧条件下，具有氨氧化基因的微型生物能将NH⁺₄转化为NO^-₃，而缺氧条件下，NO^-₃能被具有反硝化功能基因的微型生物还原为N₂，这些过程直接或间接影响水体氮元素的存在形态和转化，以及水体浮游细菌的分布。从DGGE条带克隆测序结果来看，7个条带中，4个属于β-变形菌，2个属于放线菌，1个属于α-变形菌。β-变形菌是湖泊中优势细菌类群，可能与它们氨氧化和参与降解污染物的能力有关^{[34, 35]}，由此可见，东圳水库溶解氧浓度及氧化还原反应对细菌群落组成与多样性的影响是不可忽视的。

近百年来，世界各地所建水库的贮水量在内陆水体中占有相当的比重。水库的热量、溶解氧和营养物收支依其排水方式而异。分层水库中，大坝的表层出水或者深层出水对下游河流都有很大的影响。表层放水可以使得大量的浮游生物、营养盐和漂浮植物随水流进入下游河流进而对下游河流产生影响；而深层放水，特别是当水库底层水在缺氧条件下产生有毒的硫化氢时，将会对下游生物群落产生更显著的负面影响^[34]。王雨春等^[22]在百花湖水库的研究表明，西南地区深水水库，在夏季会出现一定的水体热分层现象，并导致显著的水体水化学如溶解氧分层，进而影响水库水环境质量，而近年来百花湖水库时有发生的季节性水质恶化事件，则是由于秋季温度突然降低引起的水体分层结构失稳，上下水团在垂直交替过程中耗氧和复氧机制不平衡所致。夏品华等^[35]对红枫湖水库的研究也发现突发性水质恶化与水体分层失稳有关，在初秋季节，由于气温的骤变，上下层水体发生等温对流，下层富集的还原物质及营养盐向上迁移，还原物质氧化消耗水中溶解氧，使水体缺氧，在缺氧和H₂S等有毒物质的作用下，容易发生水质恶化事件，出现鱼虾等水生生物死亡的现象。浮游细菌作为水库生物群落中的关键与优势类群，对水体环境变化十分敏感^{[7, 8, 9, 10]}。本研究表明，浮游细菌的群落结构具有明显的垂直分布特征，特别是在亚热带热分层水库的上层和下层水体间存在显著差异，提示我们在对分层水库的研究中不应只研究表层水体。研究季节性热分层水库细菌群落结构与环境因子变化的关系可能是解答富营养化过程和机理的关键之一，而溶解氧在今后的研究中也应引起足够的重视。这些都将为水库富营养化治理、蓝藻藻类水华防控、水质优化管理等提供基础资料和科学依据。