广西地处南亚热带，适合甘蔗生长，是我国重要的蔗糖生产基地。但广西甘蔗单产较低，究其原因主要是土壤贫瘠、养分供应不足、施肥不当。土壤微生物是有机质和养分转化、循环的动力，在土壤肥力形成和发展的许多方面发挥着极其重要的作用^[1]。而施肥又是影响土壤微生物数量及其多样性的重要农业措施^[2]。施用有机肥料或实行秸秆还田，可以显著的提高土壤微生物数量，过量的施用NPK肥料，会降低土壤微生物多样性^[3]。同时，土壤理化性质对微生物群落的影响在养分循环中发挥着重要的作用。土壤微生物也能够迅速对周围环境的变化做出反应^[4]。目前，研究施肥和土壤养分对微生物的影响已经成为当前土壤科学的研究热点^[5]。 但广西红壤甘蔗生产过程中土壤微生物群落结构是如何影响土地质量和甘蔗产量的还未见相关深入研究报道。本文探讨不同施肥制度对广西甘蔗地土壤微生物群落结构的影响，旨在阐明不同施肥措施对甘蔗生产和维护土壤质量的作用，进而选择合理的施肥制度，为广西红壤地甘蔗生产提供理论依据和指导。

1 材料与方法 1.1 试验点基本情况

试验地点位于广西中南部南宁市武鸣县锣圩镇，地处南宁市西北方向的武鸣盆地西部，地势平坦宽阔，距离南宁市80km。属亚热带季风气候，夏长冬短，霜雪少见，植物四季常绿，特别有利于发展亚热带果品作物。土壤类型为广西典型的沙页岩发育的赤红壤。

地理坐标为东经23°14′49″，北纬108°2′50″，坡度为1/50，属平原旱地类型。监测点的年平均气温为21.5℃，1月平均气温为14.5℃，7月平均气温为28.8℃，年平均日照1660h，无霜期平均343d。年平均降雨量1100—1700mm，降雨量中夏季占45%，秋季占30%，春季占16%，冬季占9%。

甘蔗试验区种植前土壤养分性状如下：pH值5.68，速效磷11.3mg/kg，速效钾123mg/kg。

1.2 试验设计

试验使用的肥料为尿素、钙镁磷肥和氯化钾。氮肥和钾肥分 3 次施用，苗肥占 20%，分蘖肥占 30%，伸长肥占 50%，磷肥作苗肥一次性施用。各处理均设 3 次重复，小区规格为 3 m ×8 m，随机区组排列，小区之间设置隔离田埂。甘蔗品种为新台糖 22 号。各处理的肥料施用量见表 1。甘蔗于 2008 年 2 月 24 日播种。

1.3 测试方法

试验于2012年11月甘蔗收获后田间采取土壤样品。在距离地表 0—20cm处取样，每个小区取样5个点的新鲜样品混合。每个处理的3个取样小区各取100g土在4℃条件下保存，一周后提取土壤DNA，测定土壤微生物多样性。6个样品依次标记为：1(CK)、2(常规施肥)、3(优化施肥)、4(增量施氮)、5(增量施磷)、6(蔗叶覆盖)

1.3.1 土壤DNA提取、聚合酶链反应(PCR)和变性梯度凝胶电泳

(1)主要仪器和试剂

DGGE所用仪器为The Dcode^TM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Co. )，引物扩增16S rDNA V3高变区，引物为带有GC夹子的357F GC和517R,其中V357f2GC(5 ′2CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG23)′,V517R(5 ′2ATTACCGCGGC TGCTGG23)′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(2)抽提土壤总DNA

DNA的提取参照Miller^[18]的方法，采用基因组DNA纯化试剂盒(Fast DNA SPIN for Soil Kit ) 提取纯化土壤中总基因组DNA，然后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。DNA的定量测定用紫外分光光度仪 (日本岛津UV21600) 测量样品在260 nm和310 nm的吸光值，然后根据公式计算DNA的浓度，计算公式为：

根据公式计算DNA的浓度，计算公式为:

(3)PCR扩增

5 0μLPCR体系：10×PCR buffer(含Mg²⁺)5μL，脱氧核苷酸(dNTP)1μL，上游引物500nmol/L，下游引物500nmol/L，TaqDNA聚合酶2U，模版10ng，最后加灭菌双蒸馏水至50μL。

PCR反应条件如下: 95℃,预变性3min,然后加入Taq酶,35个循环为93℃1min,48℃1min,72℃1min 10s,最后在72℃下延伸5min;扩增后的PCR产物用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

(4)变形梯度凝胶电泳(DGGE)

对于变性梯度从上到下是30%到70%，聚丙烯酰胺凝胶浓度是8%；在200V的电压下，上样量为13μL。其运行条件是: 0. 5×TAE电泳缓冲液,60℃电泳条件下，220V，12h，电泳完毕后，用0. 8μg/mL的SYBRGREEN I染色20 min，再用去离子水漂洗。将染色后的凝胶用Bio-RAD的GelDoc-2000凝胶影像分析系统拍照；用QuantityOne分析软件(Bio-Rad)分析样品电泳条带，条带的密度由该软件自动算出。

1.3.2 土壤理化性质分析方法

土壤含水量采用烘干法测定；土壤全氮采用半微量凯氏法，全磷采用氢氟酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法，全钾采用氢氟酸-高氯酸消煮-火焰光度法；碱解氮用碱解扩散法;速效磷用0.5 mol/L NaHCO₃法；速效钾用NH₄OAc浸提-火焰光度法；缓效钾采用硝酸浸提-火焰光度法；铵态氮和硝态氮分别采用氯化钾浸提-靛酚蓝比色法和酚二磺酸法测定。

2 结果与分析 2.1 不同施肥制度对甘蔗地土壤微生物群落结构的影响 2.1.1 不同施肥制度土壤微生物群落DGGE图谱分析

应用DGGE技术分离16S rDNA V3片段PCR产物，可以看到分离为若干条带(图 1)，但不同土壤样品的16SrDNA V3片段PCR产物出现的带型有一定差别，从16SrDNA V3片段PCR产物的DGGE图谱进行初步统计发现：在6种不同施肥处理下，DGGE图谱中电泳条带数目、强度和迁移率均存在差异，充分显示了微生物多样性在不同施肥处理间的差异。不同土壤间具有许多共同的条带，说明这些供试土壤之间可能存在一些共有的细菌类型，然而这些公共条带的亮度也不相同，表明土壤微生物在丰度上有明显的改变。长期蔗叶覆盖的土壤条带数量相对其它土壤明显多，说明微生物多样性最高，而长期不施用化肥(CK)的土壤可见条带数量相对其它土壤较少，说明其微生物多样性较低。

2.1.2 不同施肥制度土壤微生物群落相似性分析

聚类分析(UPGMA)表明(图 2)，6种土壤样品共分为两大族群，空白和普通NPK施肥处理为一种族群，增施氮肥、增施磷肥、优化施肥和蔗叶覆盖为另一种族群。说明增量施用化肥肥料可能会改变土壤的细菌群落结构，而长期普通化肥用量对土壤的细菌群落结构影响不大。从相似性来看，优化施肥和过量施入氮、磷养分处理土壤间的相似性比较大，达到了77%，各土壤之间的相似性都高于45.0%。

2.2 不同施肥制度对甘蔗地土壤微生物多样性指数的影响

不同施肥处理对甘蔗长期试验地土壤微生物数量和种群均有一定影响，但未能发现明显规律。其中，优化施肥处理的Simpson 指数数值最高，Shannon-Wienner指数也显示出了较高优势。总体说明，优化施肥的养分配比较为合理，已经足够植物吸收利用，可以增加根系分泌物，提供土壤微生物更多的能源物质，从而提高土壤微生物量^[6]。Simpson指数与Shannon指数变化趋势相似，随着施肥量的增加，生物多样性指数是增加的趋势。

同时，蔗叶覆盖处理的土壤微生物多样性指数也较其他处理高，尤其是Shannon-Wienner指数(图 3)。

2.3 不同施肥制度甘蔗地土壤养分对土壤微生物群落结构的影响 2.3.1 土壤全量氮、磷、钾对微生物群落结构的影响

土壤全氮和全磷含量与微生物群落结构关系密切，全磷含量对土壤微生物群落无显著影响(图 4)。说明，甘蔗地长期施用氮肥和钾肥可以促进微生物活性，优化施肥要注重氮、钾肥的稳定投入。

2.3.2 土壤速效养分对微生物群落结构的影响

从土壤养分与微生物群落结构相关性来看，速效钾>速效磷>碱解氮>缓效钾(图 5)。有研究表明^[7]，土壤中有效钾的变化与土壤中微生物群落的变化有很大关系，造成在钾矿胁迫堆肥中含有大量的微生物，尤其是土壤中对钾矿有一定降解作用的硅酸盐细菌。微生物在土壤中的大量繁殖加速了土壤中钾素的循环，使土壤中有效钾的含量大量增加，而供钾效果最差的缓效钾与土壤微生物群落形成无显著相关。

2.3.3 土壤铵态氮、硝态氮和含水量对微生物群落结构的影响

土壤铵态氮对微生物群落结构有显著影响，可以促进微生物群落的发展。铵态氮的施入会降低土壤pH值，使得甘蔗根际微生物环境发生变化(图 6)。

土壤有效性水分是微生物活性的重要资源，土壤水分能为细菌运动提供介质，土壤含水量降低到一定程度时，引起土壤水对微生物的生理胁迫^[8]。土壤水分的变化对活跃的微生物群落影响较大，水分含量过低会导致微生物数量会大幅度减少^{[9, 10]}。

3 讨论 3.1 不同施肥制度对土壤微生物群落结构相似性的影响

从微生物群落相似性来看，优化施肥和过量施入NPK肥处理土壤间的相似性达到了77%，不同施肥制度改变了土壤微生物群落结构，这与Donnell^[11]等和Kinura^[12]等报道相同。Gelsomino^[13]对两种粉沙壤土和15种其它土壤的研究表明了相同的土壤具有更为相似的微生物结构。不同的长期施肥措施虽然没有影响土壤质地的变化，但会导致有机碳含量和其它理化性质的改变，从而改变土壤微生物群落结构。Marschner^[14]等认为不同处理间土壤微生物群落结构的相似性或多样性变化主要是由于土壤微域生境的改变所致，这种改变影响了土壤生境对多种微生物的适宜性。

3.2 不同施肥制度对土壤微生物多样性的影响

推荐施肥处理的Shannon-Wienner指数数值最高，说明该施肥水平下土壤微生物种类最多。以该地块为研究对象的试验结果表明，优化施肥处理的氮、磷施用量是充足的，增加了土壤微生物肥力，甘蔗产量比常规施肥增产甘蔗 4.0%—7.78%。长期NPK化肥均衡施用，比非均衡施肥处理的农田增加了驱动CNPS养分循环的功能微生物的数量，同时增加了蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸单酯酶等土壤酶的活性，使宿根蔗土壤酶活性趋于向高活性方向转化^{[15, 16]}。蔗叶覆盖处理微生物多样性指数较高，这主要是由于蔗叶覆盖土壤中细菌的数量明显增加，蔗叶覆盖减少了土壤水分的蒸发，提高土壤温度，又有良好的保水性，有利于菌类的生长，刺激了细菌数量的增加^[17]。施用有机肥在不同程度上提高了微生物整体功能活性和丰富度，但降低了微生物群落的均匀度^[18]。 有机肥的施用也改善了土壤微生态结构，促进了土壤有益微生物增长，提高了土壤微生物多样性和改善了土壤质量^[19]。由于蔗叶还田处理对土壤理化性状和微生物的影响仍需要较长时间才能全面深入的反映出来，因此，还需要继续长期定位试验来探讨不同施肥措施对微生物群落影响的机制^[20]。后续本试验也将继续通过高通量测序的先进方法，进一步系统阐明功能群落(如氨氧化微生物，解磷菌等)和优势种群的变化特征。

3.3 土壤养分对微生物群落结构的影响

本研究中土壤氮素和钾素对微生物群落结构影响较大，施磷使土壤磷浓度明显增加，但对土壤生物数量的影响却不明显，有研究结果表明，草地土壤中磷素也不是影响土壤微生物的主要因素^[21]。施氮会引起土壤群落生物量的明显增加，土壤中的N元素被微生物吸收利用后，在体内用于合成具有重要生理作用的蛋白质、核苷酸等生物大分子^[22]。因此，土壤中N元素不足将严重限制土壤微生物的正常生长和活性。也有研究表明，氮肥的过量施入会影响甘蔗出苗情况，合理施用氮肥才是甘蔗高产的有效途径之一^[23]。不同氮肥形态对根际微生物具有显著影响^[15]，氮肥的增加可引起根系分泌物的改变，铵态氮肥使根际微生物吸入胸腺嘧啶的量减少，根际pH值下降^[24]。土壤中硝态氮含量对土壤微生物群落的恢复起到了关键作用^[25]，通常N源易利用大小顺序为：铵态氮>硝态氮>有机氮。

4 结论 4.1 不同施肥制度改变了土壤微生物群落结构

不同施肥处理对甘蔗地土壤微生物群落均有一定影响，不施肥甘蔗地土壤细菌条带数较少，微生物丰度较低，长期施肥后可提高土壤微生物多样性。 常规施肥的微生物多样性低于优化施肥和增量施肥等处理。同一母质土壤存在一些共有的细菌类型，因不同施肥处理，影响土壤全氮、磷、钾和其他理化性质的改变，进而改变了微生物群落结构。

4.2 土壤氮、钾养分显著影响微生物群落结构

微生物群落结构与土壤总N、总K密切相关，与全P无显著相关。同时，如果N源不足将严重限制土壤微生物的正常生长和活性，其中铵态氮是最易被利用的。因此，可在甘蔗地适当增加氮肥用量来提高微生物活性，从而提高土壤肥力和甘蔗产量。速效钾含量对土壤微生物群落形成的作用显著，微生物对钾的释放也会提供作物可吸收的有效钾养分。因此，可选择在甘蔗地适当增加钾肥用量用以提高微生物群落多样性，提供土壤生物肥力。