秦岭细鳞鲑(Brachymystax lenok tsinlingensis)属于鲑形目(Salmoniformes) 鲑科(Salmonidae)细鳞鲑属(Brachymystax)，为我国特有种，主要分在秦岭北麓的渭河流域较大支流中，是一种陆封型冷水性鱼类^[1]。由于其肉质鲜美、营养丰富，早在1938年就被人工引入到汉江支流湑水河中进行人工驯养^{[2, 3]}。近年来随着生存环境的恶化、不当的开发和过度捕捞等原因的影响，秦岭细鳞鲑资源急剧减少，呈点状分布在渭河上游部分支流中。1998年秦岭细鳞鲑被收录于《中国濒危动物红皮书——鱼类》中，属濒危物种，国家Ⅱ级保护水生野生动物^[4]。目前，针对秦岭细鳞鲑的研究主要集中在资源调查^[5]、生物学^{[6, 7, 8]}、胚胎发育^[9]和人工繁殖^[10]等方面，然而对其遗传背景的研究较少，仅见原居林等^[11]采用RAPD技术对黑河种群和湑水河种群的遗传多样性进行了分析。了解现有群体的遗传背景对于制定有效的保护措施十分重要。

线粒体DNA(mtDNA)由于结构简单、进化速度快和几乎不发生重组等特点，使得mtDNA成为探讨物种起源、系统发生和种内遗传分化的有效遗传标记^[12]。线粒体控制区序列(D-loop)为非编码区，因缺乏编码的选择压力而比其他线粒体基因的进化速率更快^[13]，在鱼类群体研究中被广泛应用。Wu等^[14]利用D-loop区分析了台湾近海西太平洋黄鳍金枪鱼群体与印度洋群体间的系统分化关系，未发现明显分化。孟玮等^[15]利用D-loop区揭示了塔里木裂腹鱼各群体间遗传分化显著，并且经历过种群扩张事件。王培欣等^[16]利用同样技术分析得出8个流域叉尾斗鱼种群遗传多样性很低且存在地理差异。本研究采集渭河流域几条主要支流的秦岭细鳞鲑样本，获取和分析了线粒体控制区序列，试图揭示秦岭细鳞鲑群体的组成和分化特征，从而为秦岭细鳞鲑资源的科学管理、合理保护和开发提供参考。

实验采集秦岭细鳞鲑6个野生群体，共112尾个体。样品数量、采集地及所属水系见表 1。用无水乙醇固定尾鳍标本带回实验室进行分析。采用酚/氯仿法提取基因组DNA，采用哲罗鲑(Hucho taimen)为外类群构建系统发育树。

扩增mtDNA控制区序列的引物^[17]: 正向引物为M13通用引物和引物t-pro，M13/t-pro：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CCC AAA GCT AAG ATT CTA AA-3′；反向引物s-phe：GCT TTA GTT AAG CTA CG。PCR反应体系为25 μL，其中包括1 U TaqDNA聚合酶(TaKaRa),1 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10ⅹTaq buffer(TaKaRa，含Mg²⁺)，两条引物(10 mmol/L)各1 μL，3 μLDNA模板，其余双蒸水补足。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s，共30个循环;反应结束后在 72 ℃再延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海美吉生物工程公司纯化并双向测序，测序引物为扩增引物。

测序获得的序列通过Chromas 1.45软件获得原始序列数据；利用CLUSTAL X2软件对所有序列进行比对，参照测序图进行人工校正。用DnaSP 5.0软件计算单倍型数、单倍型多样性和核苷酸多样性等；运用Arlequin 3.1软件中的分子变异(AMOVA)方法估算遗传变异在群体内和群体间的分布及遗传分化指数F_ST值及其P值(用排列测验法，1000次重排后的显著性检验)，碱基不配对分析和Tajima′s D检验来推断种群发生扩张的历史；用Mega 4.0软件统计碱基组成，并基于Kimura 2-papamter模型以细鳞鲑的近缘物种哲罗鲑Hucho taimen为外类群，用最大简约法(Maximum parsimony，MP)和邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统进化树，系统树中节点的自举置信水平应用自引导估计，循环次数为1000次。利用PAUP×4.0 软件构建最大似然法(Maximum likelihood，ML)系统发育树。Network软件构建最小网络图，用以检测单倍型之间的进化关系。

对所得序列进行比对分析，得到目的片段长度为891bp。6个群体共检测到42个多态位点，其中39个简约信息位点，3个单突变位点。T、C、A、G平均含量分别为30.8%、23.1%、31.7%和14.5%，A+T含量(62.5%)高于G+C含量(37.5%)。转换/颠换平均值为5.2。

秦岭细鳞鲑112尾个体共检测到26个单倍型，碱基序列总的单倍型多样度较高，为0.883，核苷酸多样度为0.00799。秦岭细鳞鲑各群体多样性信息如表 2所示，群体内单倍型多样性以马鹿河最高为0.921，核苷酸多样度以岷县那布大河最高为0.03635。马鹿河群体与千河群体共享单倍型H1和H5，与东岔河群体共享单倍型H7和H12。西河群体与那布大河群体有两个共享单倍型H2和H3。在所有单倍型中H2分布最广，分布在除马鹿河外的其它五条河流，共35个个体，漳河群体仅有H2一个单倍型，认为漳河群体受“创立者效应”的影响最大，未形成新的遗传变异。

秦岭细鳞鲑群体AMOVA分析结果显示，39.95%的分子差异位于群体间，60.05%的分子差异位于群体内，群体间遗传分化极显著(F_st=0.39947；P=0.00)(表 3)。通过计算两两群体间F_st值得到的结果显示，那布大河群体与漳河群体和千河群体之间差异不显著，其余两两群体之间F_st值统计检验均显著。其中，漳河群体与马鹿河群体间的F_st值最大(0.63487)，漳河群体与那布大河群体间的F_st值最小(0.06885)(表 4)。

以近缘种哲罗鲑(Hucho taimen)为外群，采用3种不同方法(MP、ML和NJ)构建系统发育树来 分析不同水系之间的秦岭细鳞鲑种群之间的关系(图 1)。3种方法构建的系统发育树具有完全一致的拓扑结构，区别在于节点的支持率有所不同。从系统树可以看出，26个单倍型形成的谱系分支中16个单倍型形成一个大分支，该分支中包括马鹿河群体、东岔河群体全部单倍型和千河群体中的2个单倍型，主要集中在渭河中游，除马鹿河群体以外5个群体的部分单倍型构成一个混合分支。而渭河上游西河种群5个单倍型独立构成一个小分支。

图 1 基于D-loop区序列构建秦岭细鳞鲑的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree for Brachymystax lenok tsinlingensis base on mitochondrial D-loop sequences 由于MP、ME和NJ系统发育树的拓扑结构相同，此处仅显示NJ系统发育树，节点上数据从左到右为MP/ML/NJ的BP值(%，仅显示≥50%的值)

图选项

采用NETWORK构建的单倍型最小网络图显示(图 2)，大多数单倍型之间只有1步突变，中心单倍型H2与西河(单倍型H21、H22)和马鹿河(单倍型H7、H9)之间经过2步突变，H2与千河(单倍型H4)和西河(单倍型H23)之间经过3步变异，做为渭河上游河流西河的特异单倍型H23和中游河流千河特异单倍型H4位于同一推测进化分支上，中间经过mv1和mv4两个丢失单倍型，推测认为千河群体和西河群体之间有过基因的交流，相互交流的通道就是渭河干流。所得到的26个单倍型按其所处地理位置基本演化为两支，一支由千河、马鹿河和东岔河群体组成，另一支以渭河上游的漳河、那布大河和西河种群为主。网络图进一步支持了系统发育树的分析,秦岭细鳞鲑6 个地理群体的单倍型按照渭河上游和渭河中游两个河段形成两个大的类群，并在两大类群中有共享单倍型存在，暗示秦岭细鳞鲑在渭河上游和中游之间存在一定的基因交流。

图 2 秦岭细鳞鲑单倍型最小进化网络关系 Fig. 2 Haplotypes minimum spanning network for Brachymystax lenok tsinlingensis 由于MP、ME和NJ系统发育树的拓扑结构相同，此处仅显示NJ系统发育树，节点上数据从左到右为MP/ML/NJ的BP值(%，仅显示≥50%的值)

图选项

采用Arlequin 3.1软件分析秦岭细鳞鲑的种群动态，利用歧点分布和Tajima′s D中性检测分析秦岭细鳞鲑是否经历种群扩张。结果显示，秦岭细鳞鲑所有种群的检测中，歧点分布(Mismatch-distribution)分析图谱呈现多峰型(图 3)，在中性检验中Tajima′s D值为负值但差异不显著(Tajima′s D=-0.18715，P=0.64950)，表明秦岭细鳞鲑在各水系的种群大小保持相对稳定,未发生明显的种群扩张。

图 3 秦岭细鳞鲑种群的歧点分布分析图 (其中实线代表期望值,虚线代表观察值) Fig. 3 Mismatch-distribution analysis of Brachymystax lenok tsinlingensis (solid lines represent the distribution expected，dotted lines represent the observe distribution) 由于MP、ME和NJ系统发育树的拓扑结构相同，此处仅显示NJ系统发育树，节点上数据从左到右为MP/ML/NJ的BP值(%，仅显示≥50%的值)

图选项

一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力与群体遗传结构和遗传变异密切相关，种群遗传多样性水平、形成机制及分布格局的研究，可揭示物种的进化历程，单倍型多样度(h)和核苷酸多样度(π)是衡量群体遗传多样性的重要指标^[18]。渭河流域6条支流的112尾个体共检测出26个单倍型，单倍型多样度h和核苷酸多样度π分别为0.883,0.00799，显示出较高的遗传多样性。这与夏颖哲等^[17]对渭河秦岭细鳞鲑种群的单倍型多样度h=0.622和核苷酸多样度π=0.0017的研究结果有差异，本研究得出的研究结果较高，这可能与采样数量和采集地范围较小有关。原居林等采用RAPD技术对湑水河秦岭细鳞鲑种群分析得出其遗传多样性较低，湑水河作为秦岭细鳞鲑第一个人工移植驯化点，其遗传多样性较低可能是由于引入的亲鱼数量较少，群体所含变异少，导致“奠基者效应”和近交压力，从而引起该群体遗传多样性低的缘故。

AMOVA分析结果显示，遗传变异主要发生群体内，占60.05%，而种群间遗传变异占39.95%。群体间遗传分化极显著(F_st=0.39947；P=0.00)，除那布大河群体与漳河群体和千河群体之间F_st差异不显著之外，其余两两群体之间F_st值统计检验均为显著，表明各群体之间出现了一定程度的分化，这可能与秦岭细鳞鲑自身的散布能力较差和基因交流通道受阻有关^[12]。在漳河的13尾个体，仅检测到一个单倍型H2，遗传多样性贫乏，对这一现象最普遍的解释是种群遭受瓶颈效应后，受到“奠基者效应”的影响^[19]。

生物多样性与物种进化历程紧密相关，在秦岭细鳞鲑6个种群之间都共享一定的单倍型，其中单倍型H2为5个群体所共享，漳河的13尾个体仅有1个单倍型H2，说明渭河流域秦岭细鳞鲑来源于同一祖先群体，且在部分河流奠基者效应放大，遗传变异较少，这与样品采集范围大小有关。分支系统树显示，秦岭细鳞鲑可以按照渭河上游与中游大体分开的地理分布格局，暗示两大群体之间基因交流受到一定限制，但是两群体间又存在共享的单倍型(H2和H3)，说明两群体并不是完全阻隔，还存在部分基因交流。在Brunner等^[20]报道了北极红点鲑(Salvelinus alpinus)种群不同地理区域间具有显著遗传分化，认为种群间基因交流低的原因可能是由于鲑科鱼类的洄游产卵和有限的散布能力决定的。

单倍型最小进化网络图显示，按照采样地理区域形成了各自的分支，单倍型H2(35个体)有更广泛的地理分布。Posada的研究^[21]认为在种群中有很高频率的单倍型可能成为內枝单倍型，并趋于更广泛的分布，作为祖先单倍型存在。由此认为秦岭细鳞鲑可能起源于单倍型H2，偶然的历史事件(底质事件或者古气候变迁)形成了瓶颈效应或者奠基者效应，使原有种群的个体数量减少，但由歧点分布和Tajima′s D中性检测得出，秦岭细鳞鲑种群未发生明显的种群扩张事件，这可能由于偶然事件发生后，使得生存环境恶劣，秦岭细鳞鲑未能很好的适应当前环境所致，这与我国鲑科鱼类的形成和地质事件的发生过程相吻合。从约距今260万年前的第四纪开始，曾有四次大的冰川进退，起源与分布在西伯利亚地区的细鳞鲑，随着冰期与间冰期的反复细鳞鲑沿日本海向南扩散至黄海和渤海，由于鲑科鱼类溯河洄游产卵繁殖的需要，沿黄河古道溯河而上，洄游至渭河流域进行产卵繁殖，随着冰川的消失，大部分种群返回到原发源地，而一部分被滞留在渭河流域的高山溪流里，并被长期封闭在那些地区^[22]。滞留在渭河流域的单倍型H2个体经过扩散，衍生出其他单倍型，后由于人类的活动范围扩大，大量涉水工程的建设，使河流失去连通性，秦岭细鳞鲑的洄游路线被阻断，使秦岭细鳞鲑的分布区沿渭河流域呈点状分布，上下游之间基因交流较少。由于渭河上游三处秦岭细鳞鲑群体之间遗传分化较低，且部分河流遗传多样性贫乏，建议将渭河上游3个秦岭细鳞鲑自然保护区(岷县秦岭细鳞鲑自然保护区、漳县秦岭细鳞鲑自然保护区和武山秦岭细鳞鲑水产种质资源保护区)做为一个整体进行重点保护。