低温冷(冻)害是黄淮海麦区频发的自然灾害之一，严重影响并制约着小麦的生长发育及产量的形成^{[1, 2]}。低温胁迫后，植物体通过形态结构、内含物质和光合作用等一系列复杂的生理生化变化，对低温环境进行响应^{[3, 4, 5, 6]}。研究表明，植物的抗寒性与细胞膜的流动性^[7]、膜脂过氧化程度^{[8, 9]}、抗氧化酶活性^{[9, 10, 11]}、渗透调节物质含量^{[12, 13]}密切相关。植物抗寒性是多基因控制的数量性状，单一的生理指标难以全面准确反映抗寒性的强弱，可结合与抗寒性有关的多个指标，利用隶属函数法^{[14, 15]}、加权法^[16]、模糊评判法^[17]、极点排序法^[18]等进行抗寒性评价。其中，加权法和模糊评判法需要人为确定指标的权重值，而权重值的大小直接影响评判的结果。隶属函数法是根据模糊数学原理，计算的隶属函数值是多项指标综合的结果，能比较准确地反映出品种间的抗寒性差异，在小麦^[14]、果桑^[15]、甘蔗^[19] 、葡萄^[20]等均有应用。极点排序法，是将与抗寒性相关的多个指标进行权重分配，通过矩阵复合运算获得综合评价结果，已在甘蔗^[18]、辣椒^[21]、黄瓜^[22]等进行了应用，而在小麦抗寒上未见报道。本文以黄淮海麦区参加区试的24个小麦品种为材料，在人工气候室模拟拔节期低温，分析其对叶片生理的影响。以低温胁迫后各性状的相对值作为抗寒性评价指标^{[14, 23]}，通过隶属函数法和极点排序法对参试品种抗寒性进行鉴定，以筛选应对春季低温胁迫的抗寒性品种及抗寒性鉴定指标，为增强黄淮海区域小麦减灾抗灾能力提供理论支持。

供试小麦品种及其供种单位如表 1所示。

2 010年10月24日在河南师范大学网室进行盆栽种植。各品种选取完整无损、大小均匀的小麦籽粒，播入米氏盆(h19cm×φ23cm)中，每盆装土2.5kg，播种30粒。随机排列，每品种4盆。三叶期每盆定苗15株，常规管理。于2011年4月5日将低温组(每品种2盆)移入人工气候室中，16℃昼(16h，12000lx)/ 10℃夜条件下正常生长1d，然后在4℃昼(16h，12000lx)/ 4℃夜低温条件下连续处理3d。对照组(每品种2盆)仍在网室中正常生长，环境温度如图 1所示。处理结束后，分别取低温和对照各品种小麦的倒一叶用于生理指标的测定，每品种重复2次。

图 1 对照组环境温度 Fig. 1 The environment temperature of Control

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相对电导率采用电导率仪法^[24]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法^[24]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250比色法^[24]，游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸浸提-酸性茚三酮显色法^[25]，丙二醛(MDA)含量采用TBA比色法^[26]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT比色法^[24]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法^[27]。

以公式1^[15]计算性状相对值x_j作为评价品种抗寒性的指标:

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以公式2和公式3计算各品种相对性状的隶属度值^{[14, 15]}。其中，与抗寒性呈正相关的各指标(可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量及SOD活性、POD活性)隶属度值以公式2计算，与抗寒性呈负相关的各指标(MDA含量和相对电导率)隶属度值以公式3计算。

每一品种相对性状隶属度值的平均数即为该品种的平均隶属度值:

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式中，U(x_ij)为i品种j指标的隶属函数值，x_ij为i品种j指标的相对值，x_jmin和x_jmax为各品种j指标相对值的最小值和最大值。

(1) 将指标相对性状值划分为5级，每一指标的得分级差(每得1分之差)记为D，以公式4计算各相对指标的得分级差D_j^[18]。

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(2) 对每一品种所测指标相对值进行分级，使每一品种的每一指标都得到相应级别值E_ij。当指标与抗寒性呈正相关时，该指标的E_ij值以公式5计算；当指标与抗寒性呈负相关时，该指标的E_ij值以公式6计算:

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(3) 指标权重系数B_j为每一指标在综合评价中的权重，以公式7进行计算:

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(4) 每一品种综合排序值V_i以公式8进行计算:

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利用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0进行数据处理和作图。

正常生长条件下，参试的24个小麦品种叶片相对电导率平均为(23.08±3.99)%(图 2)，品种间差异极显著(P<0.01)，以山农05-066(12号)叶片相对电导率表现最低，石麦19(1号)最高。低温处理后，叶片电解质外渗增加，相对电导率极显著高于对照(P<0.01)。低温处理后，不同品种小麦叶片相对电导率的极差值增加，变异系数没有明显变化。与对照相比，在供试的24个品种中，山农05-066(12号)叶片相对电导率增幅最高(291.68％)，而石麦19(1号)增幅最低，仅为72.63%。

图 2 低温胁迫下不同小麦品种叶片相对电导率 Fig. 2 Relative electrical conductivity in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组叶片可溶性糖含量为(18.05±4.41) mg/g干重(图 3)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温促进了小麦叶片可溶性糖的积累，低温处理后小麦叶片可溶性糖含量平均为(25.40±5.89) mg/g干重，极显著高于对照(P<0.01)，且不同品种间极差值增加，而变异系数没有明显变化。与对照相比，良星619(15号)叶片可溶性糖含量增加了97.80%，而石06-6136(6号)仅增加了4%。

图 3 低温胁迫下不同小麦品种叶片可溶性糖含量 Fig. 3 Soluble sugar content in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组小麦叶片可溶性蛋白含量平均为(6.09±1.98) mg/g鲜重(图 4)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温处理后叶片可溶性蛋白含量为(2.65±1.35) mg/g鲜重，极显著低于对照(P<0.01)，且品种间可溶性蛋白含量极差值亦低于对照，而品种间变异系数高于对照。与对照相比，石4185(8号)叶片可溶性蛋白含量降低幅度最高(86.73%)，而山农05-066(12号)仅降低了5.58%。

图 4 低温胁迫下不同小麦品种叶片可溶性蛋白含量 Fig. 4 Soluble protein content in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组小麦叶片游离脯氨酸含量平均为(131.36±73.70) μg/g鲜重(图 5)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温处理后，叶片游离脯氨酸含量增加，平均为(236.33±96.19) μg/g鲜重，极显著高于对照(P<0.01)，其品种间极差值亦高于对照，而变异系数低于对照。与对照相比，良星619(15号)叶片脯氨酸含量增加了350.43%，石4185(8号)仅增加了0.39%。

图 5 低温胁迫下不同小麦品种叶片游离脯氨酸含量 Fig. 5 Free proline content in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组小麦叶片MDA含量平均为(1.06±0.29) μmol/g鲜重(图 6)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温处理后，叶片MDA含量平均值为(1.68±0.46) μmol/g鲜重，极显著高于对照(P<0.01)，且品种间极差值高于对照，而变异系数无明显变化。与对照相比，石优20(2号)叶片MDA含量增加了318.32%，而石H083-363(3号)仅增加了10.34%。

图 6 低温胁迫下不同小麦品种叶片MDA含量 Fig. 6 MDA content in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组叶片SOD活性平均为(278.27±70.61) U/g鲜重(图 7)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温处理后，叶片SOD活性为(349.75±45.96) U/g鲜重，极显著高于对照(P<0.01)，且品种间极差值和变异系数均低于对照。与对照相比，石H083-363(3号)叶片SOD活性增加了171.85%，而徐麦4036(19号)仅增加了1.74%。

图 7 低温胁迫下不同小麦品种叶片SOD活性 Fig. 7 SOD activity in wheat leaves in response to low temperature stress

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对照组叶片POD活性平均为(59.57±22.83) U/g鲜重(图 8)，品种间差异极显著(P<0.01)。低温 处理后，叶片POD活性为(103.50±40.88) U/g鲜重，极显著高于对照(P<0.01)，且品种间极差值高于对照，但变异系数未有明显变化。与对照相比，B07-4056(5号)增加了388.29%，而山农05-066(12号)仅增加了10.00%。

图 8 低温胁迫下不同小麦品种叶片POD活性 Fig. 8 POD activity in wheat leaves in response to low temperature stress

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计算各指标的相对性状值列于表 2。低温胁迫后，相对电导率的相对值和相对脯氨酸含量较高，平均值达到253.27%和223.47%，其次是相对POD活性和相对MDA含量，而相对可溶性蛋白含量较低。从各性状相对值的变异系数来看，相对脯氨酸含量、相对可溶性蛋白含量、相对POD活性的变异系数较高，均高于50%，其次是相对MDA含量和相对SOD活性。

根据相对性状值，计算参试品种的平均隶属度值为0.19—0.63，综合排序值为1.66—4.08(图 9)。平均隶属度值和综合排序值高，该品种的抗寒性强；反之，该品种的抗寒性弱。根据平均隶属度值和综合排序值对参试品种进行排序，结果不完全相同，二者均以良星619表现最高，石优20表现最低。

图 9 各品种的平均隶属度值和综合排序值及其聚类类别 Fig. 9 Average of subordinate function and comprehensive score of each variety and cluster membership

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以平均隶属度值和综合排序值对参试品种进行K-Means聚类，经过4次聚类迭代后将参试品种聚为5类，各类中心值列于表 3。第Ⅰ类综合排序值和平均隶属度值均较高，抗低温能力最强；第Ⅴ类综合排序值和平均隶属度值均较低，抗低温能力最弱。

各品种的聚类类别如图 9所示。良星619、丰德存麦1号、B07-4056、石H083-363、山农055843和良星99等6个品种聚在第Ⅰ类，其抗寒性最强；宿553、陕农509、A-9、中原6号、徐麦4036、舜麦1718和石麦19等7个品种聚在第Ⅱ类，其抗寒性强；尧麦16、C-44、山农05-066、冀麦585和石B05-7388等5个品种聚在第Ⅲ类，其抗寒性中等；偃展4110、B-33、B05-6507和石4185等4个品种聚在第Ⅳ类，其抗寒性弱；石06-6136和石优20这2个品种聚在第Ⅴ类，其抗寒性最弱。

从相关关系来看(表 4)，平均隶属度值和综合排序值与叶片相对可溶性糖含量、相对脯氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，与叶片相对POD活性呈显著正相关(P<0.05)，与叶片相对MDA含量呈显著负相关(P<0.05)。二者与相对可溶性蛋白含量和相对SOD活性呈正相关，与相对电导率呈负相关。

从各品种的相对性状值来看(表 2)，良星619(15号)叶片相对可溶性糖含量和相对脯氨酸含量均最高，其平均隶属函数值和综合排序值亦排在首位，抗寒性最高。石H083-363(3号)叶片相对MDA含量最低，相对SOD活性最高，其隶属函数值和综合排序值分别为0.604和3.763，抗寒性属于第I类；B07-4056(5号)叶片相对POD活性远高于其它品种，其隶属函数值和综合排序值分别为0.566和3.837，抗寒性亦属于第I类。石优20(2号)叶片相对MDA含量远高于其它品种，其隶属函数值和综合排序值分别为0.192和1.661，其抗寒性最弱；石06-6136(6号)叶片相对可溶性糖含量和相对SOD活性较低，而石4185(8号)叶片相对可溶性蛋白含量和相对脯氨酸含量均最低，这2个品种的抗寒性均弱，仅略高于石优20(2号)。

拔节期是小麦快速生长时期，亦是对低温敏感的时期^[14]。低温胁迫下，植物细胞发生一系列生理生化变化以适应和进行自我调节^{[4, 5, 6]}。生物膜是植物细胞与外界环境之间发生物质交换的通道，各种逆境对植物细胞的影响首先作用于生物膜，常以叶片电导率作为鉴定细胞膜透性以及破坏程度的重要指标^{[7, 28]}。本研究表明，拔节期低温胁迫后小麦叶片相对电导率较对照增加。因此，低温胁迫使小麦叶片生物膜透性增加并且膜受损程度加大。

低温胁迫下可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等渗透调节物质的含量发生变化，植物可通过调节渗透浓度来启动脱落酸的形成，诱发蛋白质的合成，增加抗寒性^[9]。本研究表明，拔节期低温胁迫后，叶片可溶性糖含量和游离脯氨酸含量较对照增加，在一定程度上可以促进蛋白质的合成，但叶片中可溶性蛋白含量仍表现为低于对照。

低温胁迫下，植物体内产生大量的活性氧自由基，引发膜脂过氧化^[8]，产生膜脂过氧化产物MDA，且膜脂过氧化的程度随温度降低和胁迫时间延长而加重^[9]，同时植物体内还存在着SOD、POD等抗氧化酶系统以清除活性氧、降低逆境损伤^{[9, 10, 11]}。本研究表明，拔节期低温胁迫下，小麦叶片SOD活性、POD活性和MDA含量均高于对照。SOD活性和POD活性的增加可以减轻低温对生物膜的迫害，说明植株对低温产生了一定的响应。但是MDA含量的增加显示低温胁迫后叶片膜脂过氧化程度仍然呈现增高趋势。

不同小麦品种抗低温能力差异很大^{[8, 14, 24, 26, 27, 30, 31]}。 有研究表明，低温胁迫下小麦叶片MDA含量^{[8, 14]}、可溶性蛋白含量^[8]下降，电导率^[29]、SOD活性^{[6, 29]}、POD活性^[6]、可溶性糖含量^[14]的变化存在品种间差异或变化不明显。这主要是由于品种特性、胁迫温度强度、胁迫持续时间及小麦所处生育期不同而致。本研究表明，拔节期低温胁迫后，小麦叶片相对电导率、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、MDA含量、POD活性品种间极差值均高于对照，而可溶性蛋白含量和SOD活性品种间极差值低于对照，不同品种间各指标的增加(减少)量存在较大差异。计算各指标的相对性状值，则可以消除品种自身遗传特性的影响^{[8, 14, 15]}。本研究表明，低温胁迫后，相对电导率的相对值以及相对脯氨酸含量较高，而相对可溶性蛋白含量较低。由相对性状值，通过隶属函数法和极点排序法，计算出各品种的平均隶属度值和综合排序值，并通过K-means聚类，将参试品种聚成了5类。其中，良星619抗低温能力最强，而石优20抗低温能力最弱。

有关小麦抗寒性的评价指标，已有研究并不完全一致。刘艳阳研究认为SOD活性、MDA含量可以作为小麦抗寒性的评价指标^[6]，高志强认为电导率和可溶性糖含量是衡量小麦抗寒性较好的指标^[28]。本研究相关分析表明，叶片相对可溶性糖含量、相对脯氨酸含量、相对POD活性与相对MDA含量与平均隶属度值和综合排序值相关关系显著，认为这4个指标可以作为拔节期小麦抗寒性鉴定的主要评价指标。

本研究仅从叶片生理响应上分析了拔节期低温对小麦植株生长的影响，而小麦的抗寒性不仅包含自身的遗传因素和生理特征，更与外界环境因素密切有关。选育抗寒性强的品种、建立良种良法配套的高产栽培技术，提高小麦的抗寒综合能力，是目前小麦安全高效栽培生产中亟待解决的问题。