山核桃(Carya cathayensis Sarg.)为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属落叶乔木，11月至次年4月为休眠期，是中国特有的优质干果和木本油料树种，主要分布在浙江和安徽两省交界的天目山区，有着500多年的栽培历史^[1]。随着经济的发展和山核桃价格的不断攀升^[2]，山核桃经营的集约化程度越来越高，主要的措施包括去除林下灌木、杂草，翻耕土壤，施用化肥和除草剂等。高强度的集约经营使林地生物多样性降低，在冬季大片地表裸露，水土流失严重^[3]，土壤质量下降^[4]。山核桃主要分布于土壤浅薄、岩石裸露、生态脆弱的石灰岩山地，高强度经营导致山核桃产区生态环境问题日益严重。针对这些问题，相关学者开展了林下留养杂草、种植冷季型绿肥等，在一定程度上提高了林地土壤有机质和改善山核桃林分冬季景观^{[5, 6]}。

生草是一种完全型绿肥，美国、韩国和日本等国家都大力发展绿肥产业^{[7, 8]}，大量研究表明，生草栽培可提高土壤有机质含量，改善土壤理化性状，保水保肥，提高果实产量和品质，增加土壤微生物数量和多样性，改善林地生态环境^{[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]}。根据山核桃落叶树种的生物生态学特点，为改良山核桃林地土壤，选择冷季型绿肥对林地进行自然修复十分必要。大多学者对山核桃林地生草栽培研究多集中于果园生态环境方面^{[6, 16]}，且缺乏系统研究。

大量高强度经营下的森林土壤常以土壤养分与物理性质指标来评价其土壤质量演化规律，但随着土壤长期大量施用化肥和除草剂，理化性质已逐渐失去敏感性^[17]，而具有早期预警作用的生物指标被逐渐重视。在土壤生物指标中最具有潜力的是土壤微生物多样性^[18]。土壤微生物多样性是指土壤微生物在遗传、种类和生态层次上的变化，即微生物群落的稳定性。森林土壤长期高强度集约经营使土壤微生物生物量和多样性减少^{[19, 20, 21]}。生草栽培是否有利于丰富山核桃土壤微生物多样性，不同生草对土壤微生物功能多样性是否有差异等问题尚未见报道，因此有必要探讨山核桃林土壤质量的绿肥恢复机制。本试验通过在山核桃林下栽培不同生草，研究了不同生草栽培对山核桃林地土壤养分、微生物生物量碳的影响，采用Biolog Eco法研究土壤微生物功能多样性的变化，以期为山核桃林地土壤管理、制定环境生物修复方案提供微生物学依据。

试验点位于浙江省临安市昌化镇迎丰村山核桃生态示范园区，地理位置为30°03′02″N，119°08′54.2″E，海拔211 m，坡度30°，北坡，树龄20—25a，平均密度600 棵/hm²。土壤类型为石灰土。属中亚热带季风气候，具有春多雨、夏湿热、秋气爽、冬干冷的气候特征，全年降雨量1628.6 mm，年平均气温16.4 ℃，年降水日为158 d。

2010年9月在昌化镇迎丰村山核桃示范园区布置生草栽培试验，共设6个处理，分别是白三叶 (Trifolium repens)，1年生黑麦草 (Lolium multiflorum)，紫云英 (Astragalus sinicus)，油菜(Brassica campestris)，自然杂草(园区内自然生长的杂草，主要为狗牙根、看麦娘、雀稗)，以传统清耕作业(4、8月上旬喷施20%百草枯水剂375 kg/hm²进行除草)为对照，山核桃采收后将生草播种于山核桃林下，播种方式为撒播，播量平均为30 kg/hm²。采用单因素随机区组设计，每种处理设3次重复，每个小区面积为10 m×7 m。生草方式为全园生草，连续2a播种，各小区水肥管理保持一致，4月和8月施肥两次。肥料为农家有机肥，平均每棵山核桃施肥10—15 kg。

2012年4月中旬(生草旺盛生长时期)采用五点采样法采集各处理0—20 cm的土样，去除土壤中的石块和植物，过2 mm筛，混匀，用四分法分成两部分，一部分鲜土样立即测定土壤微生物量碳和微生物功能多样性，另一部分自然摊晾，风干后用于土壤养分测定。

土壤有机质采用重铬酸钾-硫酸外加热法；水解氮采用碱解扩散法；全氮采用凯氏定氮法；有效磷采用Bray法，盐酸-氟化铵溶液浸提、钼锑抗比色法；速效钾采用乙酸铵浸提，原子吸收法；土壤全磷、全钾采用硝酸-高氯酸-氢氟酸消煮法^[22]。

土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸，用0.5 mol/L K₂SO₄溶液浸提，提取液用TOC-V_CPH有机碳分析仪测定^[17]。土壤的微生物代谢活性和功能多样性采用Biolog Eco检测法^{[21, 23]}。实验步骤为：称取相当于10.0 g烘干土壤重量的新鲜土壤，加入装有100 ml 无菌蒸馏水的三角瓶中，封口后置于摇床振荡30 min(250 r/min)，得到土壤微生物悬浮液，静止15 min后取上清液，在超净工作台中，用无菌水将其浓度稀释到10^-3，用8孔加样器将稀释好的土壤悬浮液加到Biolog Eco生态板(ECO MicroPlant,美国Marix Technologies Corporation)中，每孔125 μL。将接种好的Eco板置于25 ℃培养箱中连续培养7d；每隔24 h用Biolog微平板读数仪进行吸光值的测定，测定波长为590 nm。

土壤微生物代谢活性采用每孔颜色平均变化率(AWCD)来表示。对Biolog Eco 板培养96 h的数据进行统计分析，采用Shannon多样性指数(H)和均匀度指数(E)来表征土壤微生物群落代谢功能多样性。计算公式如下：

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式中,C_i为除对照孔外各孔在590 nm下的吸光值，R为对照孔A1的吸光值，C_i-R小于0的孔，计算中记为0；P_i第i孔的相对吸光值与整板相对吸光值总和的比率；S为Eco板颜色变化的孔的数目。

实验数据处理和统计分析采用SPSS18.0，Excel 2007和DPS 7.05，所有数据为3次重复的平均值。

由表 1可以看出，6种不同处理的山核桃林地土壤有机质、水解氮、速效钾、有效磷、全氮、全钾和全磷含量均存在不同程度的差异。白三叶栽培处理的土壤水解氮、速效钾和有效磷均为最高，分别达到224.14、91.67和16.37 mg/kg，分别较清耕提高了41.4%、149.9%和85.8%；其次为紫云英处理，分别为212.45、59.17和14.79 mg/kg；黑麦草、油菜和自然杂草处理土壤水解氮、速效钾和有效磷差异不明显。

从全量含量分析可知(表 1)，生草栽培对山核桃林地土壤均有较好的改良效果，白三叶、油菜和紫云英处理的全氮和全磷含量均较高，与清耕处理相比，达到5%水平差异，而白三叶和紫云英处理的全钾含量最低，显著小于清耕处理，这可能是由于豆科牧草在表土层与山核桃根系存在养分竞争所导致；其中白三叶处理的全氮含量最高，为2.28 g/kg，比清耕处理提高了36.5%；油菜处理的全钾含量最高，为9.80 g/kg，比清耕提高了6.7%；紫云英处理的全磷最高，为0.294 g/kg，相较于清耕提高了75.0%，涨幅明显。自然杂草处理的效果好于黑麦草处理，黑麦草处理全钾和全磷与清耕相比无明显差异。

白三叶、黑麦草、紫云英处理的土壤有机质含量均高于清耕对照，差异明显，达显著水平。其中白三叶和紫云英提高效果最明显，分别为38.68、37.72 g/kg，比清耕分别提高了35.1%和31.7%，涨幅明显高于其他处理。自然杂草处理与清耕处理无显著差异，这主要是自然杂草在林中生长不佳，生物量较小，因而归还的有机物料也较少。可见山核桃林地进行生草栽培能显著提高土壤肥力，改善土壤养分状况。

微生物生物量碳(MBC)是土壤有机碳库中非常活跃的组分，近几年来被认为是反映土壤质量变化的重要指标之一，已有研究显示地上植被类型不同，其土壤微生物生物量碳差异明显^[22]。通过2年生草栽培，分析测定了山核桃林地土壤微生物生物量碳。从图 1可以看出，不同生草栽培处理土壤MBC均显著高于清耕，说明生草栽培能使山核桃林地土壤微生物特性明显改善。研究发现，白三叶处理土壤MBC最高，相比较于清耕，提高了169.6%；其次为黑麦草、紫云英和油菜，但处理间差异不显著，分别较清耕提高了159.6%，144.1%和138.6%；自然杂草处理土壤MBC较低，仅为166.4 mg/kg，较清耕提高了58.6%。

图 1 不同生草栽培对土壤微生物生物量碳的影响 Fig. 1 Soil microbial biomass carbon with different treatments of sod-culture

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从图 2可知，随着培养时间的延长，各处理的AWCD值呈抛物线模式。不同处理的土壤微生物活性都随时间的增加而提高。6种不同处理土壤的AWCD在24 h内无明显变化，在24 h后快速上升，在144 h达到最大值后逐渐减慢，保持稳定。比较所有处理，白三叶处理效果最好，在所有培养时间内均高于其他处理，当达到144 h后，其微生物活性略有减小；其次是紫云英处理；清耕处理的土壤微生物群落功能多样性最差；黑麦草、油菜和自然杂草处理间无显著差异，但较清耕处理效果明显。说明生草栽培能改善林地土壤的微生物特性。结合土壤养分分析，可知豆科植物无论是在提高土壤肥力还是改善土壤微生物特性上，效果均优于禾本科植物。

图 2 不同生草栽培土壤微生物AWCD随培养时间的变化 Fig. 2 Average well color development changes during incubation of soil microbial community with different treatments of sod-culture

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利用培养96 h后测定的吸光度值为数据，运用DPS软件对数据进行主成分分析(PCA)。

3 1个主成分因子前9个的累积方差贡献率达到86.96%，其中前3个较大的主成分方差贡献率为33.20%、11.51%和10.62%。从中提取可以聚集为单一碳源变量的数据变异(累积方差贡献率)为44.71%的前2个主成分(PC1、PC2)来进行微生物群落功能多样性分析。结果表明(图 3)，不同处理在PC轴上出现了明显的分异，PC1将白三叶处理和清耕处理与其他处理区分开来，且白三叶处理处于PC1的最正端，清耕(对照)处理处于PC1的负端。油菜和自然杂草处理在PC1轴上距离较大，且各有1个重复与其他2个重复的距离较远。紫云英处理在PC1轴上的主成分值为-2—2，在PC2轴上为-1—-5。黑麦草处理在PC1和PC2轴上差距均较大，3个重复的距离较远。

图 3 不同生草栽培土壤微生物碳源利用率的主成分分析 Fig. 3 PCA analysis of carbon sources by soil microorganisms under different treatments of sod-culture

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不同生草处理间土壤微生物多样性指数存在一定的差别(表 2)。Shannon指数大小顺序为白三叶＞自然杂草＞油菜＞紫云英＞黑麦草＞清耕，白三叶处理的Shannon指数最高，为3.786；清耕最低，为3.335；油菜、紫云英和自然杂草处理的Shannon指数都很高，但三者之间差异不显著(P＞0.05)。

对不同处理而言，土壤微生物均匀度指数存在不同程度的差异。均匀度指数大小的顺序为白三叶＞紫云英＞油菜＞自然杂草＞黑麦草＞清耕，白三叶、油菜和紫云英均匀度指数较高，分别为0.980、0.969和0.972，但三者之间未达到显著差异，自然杂草处理的均匀度指数为0.965，黑麦草的均匀度指数较低，为0.936；清耕处理最低，为0.933。相较于清耕，白三叶的Shannon多样性指数和均匀度指数均为最高，黑麦草的两指数均为最低，油菜、紫云英和自然杂草处理三者间无论是多样性指数还是均匀度指数差异均未达显著水平。

将96 h每孔平均颜色变化率AWCD值、微生物Shannon指数(H′)、均匀度指数(E)与土壤各肥力指标进行相关分析，如表 3所示，96 h AWCD值、微生物Shannon指数(H′)、均匀度指数(E)两两之间均达到了极显著相关(P＜0.01)，AWCD和Shannon指数与有机质、有效磷两指标达到了显著相关(P＜0.05)，与其余肥力指标之间虽未达到显著相关，但都存在正相关关系。土壤各肥力指标之间均达到显著或极显著相关。

本试验通过常规分析方法、氯仿熏蒸法和Biolog-Eco法对不同生草栽培处理下山核桃林地土壤养分、土壤微生物生物量碳和土壤微生物多样性进行了研究，试验结果显示，相较于清耕处理，生草栽培能明显提高土壤肥力，改善土壤养分状况。有研究认为，生草栽培对土壤肥力有显著改善，增加土壤养分和有机质含量^{[10, 26, 27]}。栽培生草后土壤环境与结构发生改变，导致土壤通气性、水势梯度和热传导性随之改变，为微生物创造了适宜的生存和繁殖条件，同时刈割生草覆盖后，生草的腐烂物为林地土壤微生物提供了丰富的营养物质，更适合微生物的繁殖^[28]。微生物的大量繁殖促进了土壤养分的转化，加之生草与土壤微生物及其他生物的作用，转化为可供吸收的营养物质，提高土壤养分含量。种植生草每年通过凋落物归还，细根周转和根系分泌等可向土壤归还大量的有机质，而清耕则造成土壤有机质的加速分解，同时失去地被层的保护，水土流失严重。本研究与前人结果基本一致。

土壤微生物生物量碳是土壤中活的有机质成分，可作为衡量土壤肥力及质量变化的重要指标。毛竹林地播种绿肥能明显增加土壤微生物生物量碳的含量，表现为白三叶＞大绿豆＞黑麦草＞黑麦草、白三叶和大绿豆混播＞对照^[29]。种植不同牧草对复垦红壤土壤根际微生物量碳发生了显著变化，为黑麦草+三叶草＞三叶草＞黑麦草＞未种植土壤，处理间差异达显著水平^[30]。本研究结果表明所有生草处理土壤微生物生物量碳含量均明显高于清耕，白三叶处理最好，其次为黑麦草、油菜和紫云英处理，但处理相互间无显著差异，自然杂草处理较差。

Biolog法在土壤微生物群落多样性的研究中应用较为广泛^{[25, 31, 32, 33]}，所得微生物功能多样性特征与土壤基本特征都能建立较好的联系。本文通过Biolog Eco法研究了山核桃林地不同生草栽培的土壤微生物多样性，结果显示，不同生草处理的微生物活性(AWCD)、土壤微生物Shannon指数和均匀度指数均有一定的差异，生草处理的土壤微生物活性和多样性指数(Shannon指数和均匀度指数)显著高于清耕。土壤微生物活性(AWCD)以白三叶处理最高，清耕处理最低；紫云英、黑麦草、油菜和自然杂草4种处理相互间差异不显著，但均高于清耕处理；Shannon指数大小顺序为白三叶＞自然杂草＞油菜＞紫云英＞黑麦草＞清耕(对照)，均匀度指数大小的顺序为白三叶＞紫云英＞油菜＞自然杂草＞黑麦草＞清耕(对照)。地上植物种类组成，植物残体、根的生物量、根系分泌物和土壤理化性质等可能是导致这种差异的主要原因^[34]。之所以白三叶处理的土壤微生物功能多样性会高于其他生草处理，这可能是因为白三叶为多年生草本，根系发达，播种后能快速生长，迅速郁蔽地面，且终年不枯，种子成熟后，自然脱落，可于第二年更新，不需复播。白三叶植物根际释放大量的碳源，较高浓度的碳源促进了土壤微生物群落代谢活性的提高^[35]。

本研究表明，不同生草处理的土壤微生物AWCD、微生物Shannon指数和均匀度指数两两之间的相关性均达到极显著水平(P＜0.01)，与土壤养分各指标之间存在正相关关系。这与安韶山等对宁南山区9种典型植物土壤AWCD、微生物多样性指数和均匀度指数两两之间均达到极显著相关类似^[25]。

不同生草栽培处理的土壤养分、微生物生物量碳、土壤微生物活性(AWCD)、Shannon指数和均匀度指数存在不同程度的差异。相较于清耕处理，生草栽培处理的土壤有效元素和全量元素含量均明显增加。土壤养分分析中，白三叶和紫云英处理较优，黑麦草处理较差。

生草栽培可以明显增加土壤微生物生物量碳含量，白三叶处理最高，与清耕相比，提高了169.6%，其次为黑麦草、紫云英和油菜，分别较清耕提高了159.7%，144.1%和138.6%，但三者间无显著差异，自然杂草处理较低，仅为166.37 mg/kg，较清耕提高了58.6%。

不同生草处理的土壤微生物对相同碳源的利用、对碳源消耗量及速率上的差异，表明其代谢强度不同；不同处理的土壤每孔颜色变化率AWCD为白三叶＞紫云英＞油菜＞自然杂草＞黑麦草＞清耕。不同处理的土壤Shannon指数和均匀度指数，白三叶最高，清耕最低；两指数在不同处理间具有一致性。96 h平均颜色变化率(AWCD)、Shannon指数和均匀度指数两两之间均达到了极显著相关，与土壤肥力指标之间存在正相关关系。