生态学报  2014, Vol. 34 Issue (14): 3885-3894

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许星鸿, 张雁秋, 阎斌伦, 徐加涛, 房树全, 周黎, 刘艳晴, 黄福林
XU Xinghong, ZHANG Yanqiu, YAN Binlun, XU Jiatao, FANG Shuquan, ZHOU Li, LIU Yanqing, HUANG Fulin
氨氮胁迫对日本蟳免疫生理指标及器官结构的影响
Effects of ammonia-N stress on immunity-related indicators and histological structure of some organs of the marine crab, Charybdis japonica (A. Milne-Edwards)
生态学报, 2014, 34(14): 3885-3894
Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(14): 3885-3894
http://dx.doi.org/10.5846/stxb201211291707

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收稿日期:2012-11-29
修订日期:2014-2-27
氨氮胁迫对日本蟳免疫生理指标及器官结构的影响
许星鸿1, 2, 张雁秋1 , 阎斌伦2, 徐加涛2, 房树全2, 周黎2, 刘艳晴2, 黄福林2    
1. 中国矿业大学环境与测绘学院, 徐州 221008;
2. 淮海工学院海洋学院, 连云港 222005
摘要:采用生物酶测定及组织学方法,研究了水体中不同浓度氨氮胁迫下日本蟳免疫相关指标的变化,以及对鳃、肝胰腺和胃等器官结构的影响。结果表明:在氨氮胁迫下,各实验组的血细胞密度(DHC)、血蓝蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,以及低浓度胁迫组的酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活力呈“先升后降”的变化趋势;高浓度组LSZ活力持续下降。在低浓度氨氮胁迫下,过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量呈“先升后降再升”,而高浓度氨氮胁迫导致MDA含量持续上升。胁迫第15天,除低浓度组的DHC、血蓝蛋白含量和PO活力略高于对照组外,其他实验组所测指标均低于对照组;PO、LSZ、SOD和CAT等酶活力以及DHC均与氨氮胁迫浓度呈显著负相关,MDA含量则与胁迫浓度呈显著正相关(P <0.01)。高浓度氨氮胁迫会导致鳃几丁质膜变薄、断裂,鳃上皮排列紊乱、染色质异固缩;鳃腔中血淋巴减少,密度降低,血细胞凝集、质膜破裂,胞质严重空泡化;肝胰腺上皮形态不规则,B细胞减少,腺细胞出现大量空泡,染色质凝聚;胃几丁质膜断裂,胃上皮排列不规则,胞质中出现大量残余体。研究表明高浓度氨氮胁迫对日本蟳免疫相关指标和器官结构产生显著影响,SOD活力和MDA含量长期变化情况可作为衡量日本蟳在氨氮胁迫下免疫状态的指标。
关键词氨氮胁迫    日本蟳    免疫指标    器官结构    
Effects of ammonia-N stress on immunity-related indicators and histological structure of some organs of the marine crab, Charybdis japonica (A. Milne-Edwards)
XU Xinghong1, 2, ZHANG Yanqiu1 , YAN Binlun2, XU Jiatao2, FANG Shuquan2, ZHOU Li2, LIU Yanqing2, HUANG Fulin2    
1. School of Environment Science and Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221008, China;
2. School of Marine Science & Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China
Abstract:Charybdis japonica is an important marine crab, that is widely distributed in the China sea area. Enzymatic and histological methods were used to analyze changes in the activities of immune-related enzymes in the blood serum, and in the histology of major organs of this crab exposed to different levels of ammonia-N stress. The primary objective of the study was to provide a theoretical basis for research into ammonia-N toxicity in relation to the control of water quality in artificial cultures of this crab.

The crabs were exposed to ammonia-N concentrations of 0, 2, 5, 10, 15, and 20 mg/L for up to 15 days. After times of 0, 1, 3, 5, 10, and 15 days, blood samples were taken for measurement of changes in immunity-related indicators, including the density of hemocytes (DHC); hemocyanin concentration; the activities of phenoloxidase (PO), lysozyme (LSZ), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT); and the malondialdehyde (MDA) concentration. On day 15, samples were taken of the gills, hepatopancreas and stomach tissue of the crabs in the 20 mg/L of ammonia-N medium, for observations of histological changes.

Many of the measured indices showed an initial increase in response to ammonia-N stress, which was followed by a decreasing trend over time. This was observed in the values of DHC and hemocyanin concentration, in the activities of the SOD and CAT in all treatments, and in the activities of the PO and LSZ in the experimental groups at low ammonia-N concentrations. In contrast, the LSZ activity declined continuously in crabs at high concentration of ammonia. At low ammonia-N concentrations, the MDA content initially increased, and then decreased, and finally rose again. At higher concentrations, MDA continuously increased. After exposure to ammonia-N for 15 days, most of the measured indices were lower in the ammonia-N treatments than in the control group, with the exception of DHC, hemocyanin concentration, and PO activity, which were slightly higher. There were significant negative correlations between ammonia-N concentration and DHC, and ammonia concentration and the activities of PO, LSZ, SOD, and CAT. In contrast, the MDA content was positively correlated with the ammonia-N concentration (P <0.01). Noticeable changes were observed in the histological structure of some organs in crabs exposed to high concentrations of ammonia-N. The chitin layer of the gills became thin and was partly ruptured, the epithelial lamina became disorganized, and the chromatin condensed. The quantity of hemolymph in the gill cavity was reduced and its density decreased. Hemocytes were condensed with ruptured cytomembranes and abundant vacuoles in cytoplasm. The glandular epithelium exhibited an irregular morphology, the number of secretory cells (B-cells) decreased and numerous vacuoles appeared. There were fewer organelles and the chromatin was condensed. The chitin layer of the stomach ruptured and the gastric epithelium became disordered, with abundant residual bodies formed in the cytoplasm.

We conclude that high concentrations of ammonia-N have significant effects on the activities of immune-related enzymes and on organ morphology in Charybdis japonica. Changes in the activities of SOD and in the content of MDA, may be used as indices for evaluating the immune state of C. japonica under ammonia-N stress.

Key words: ammonia-N stress    Charybdis japonica    immunity-related indicators    histological structure    

氨氮是养殖水体中常见的污染因子之一,氨氮胁迫会造成水生动物摄食减少、生长率下降[1],免疫力降低甚至会引起疾病的暴发[2]。关于氨氮对水生动物的毒害机制已有一些报道,Randall等[3]发现氨中毒会导致鱼类呼吸道上皮损伤、神经系统紊乱;洪美玲等[4]报道高浓度的氨氮胁迫会抑制中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)抗氧化酶活性并造成肝细胞核解体。日本蟳(Charybdis japonica)为分布较广且经济价值较高的海产蟹类[5],随着养殖规模的扩大,环境胁迫对其生理机制的影响亦日益受到关注。王春琳等[6]分析了硫酸铜蓄积对日本蟳保护酶系统的影响,张红霞等[7]就重金属离子对日本蟳抗氧化酶活力的影响进行了探讨,许星鸿等[8]报道了亚硝态氮胁迫下日本蟳免疫相关指标的变化规律,但迄今尚未见有关氨氮胁迫对日本蟳毒害机制的研究报道。本文运用酶学和组织学的实验方法,研究氨氮胁迫对日本蟳血淋巴免疫生理指标及鳃、胃、肝胰腺等器官结构的影响,旨在探讨氨氮胁迫对日本蟳的毒性机理,为养殖水环境调控及病害防治提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

日本蟳于2011年9月购自连云港市高公岛码头,采用生态闭路循环养殖系统暂养7 d,盐度25,pH 8.0,水温20 °C,自然光照,连续充气,1日投喂2次鲜活贝类。选择附肢完整、活力强者用于实验,体质量为(82.35±15.72)g。

1.2 实验设计

氨氮源为氯化铵,为国产分析纯。根据养殖水体通常的氨氮污染浓度[9],本实验氯化铵浓度设6组:对照组(0 mg/L)、低浓度组(2和5 mg/L)、中浓度组(10和15 mg/L)和高浓度组(20 mg/L),每组设3个平行,每个平行随机取25只蟹,饲养15 d。水温、投饵、充气等养殖条件与暂养时相同。每日定时换水2次,每次更换水体的50%,并维持各组氯化铵质量浓度。

1.3 实验方法 1.3.1 免疫生理指标的测定

免疫相关指标选用血细胞密度(DHC)、血蓝蛋白含量、酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力及过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量。于实验0、1、3、5、10、15 d,每缸随机抽取3只蟹采集血样,测定各项免疫指标。用无菌注射器先吸取ACD抗凝剂[10]1 mL,再由蟹第3步足基关节处按1 ∶ 1比例抽取血淋巴,充分混匀后,用血球计数板计数,计算血细胞密度,然后用分光光度计测定血蓝蛋白含量[11]

将血淋巴5000 r/min冷冻离心10 min,取上清液即为血清,-80 ℃冷冻保存待测酶活。PO测定采用Ashida[12]的方法,LSZ活力测定采用Hultmark[13]的方法,SOD测定采用邻苯三酚自氧化法[14],CAT测定采用Góth[15]的过氧化氢法,MDA含量采用南京建成生化试剂盒测定。

1.3.2 组织学观察

于胁迫后第15天,从对照组与高浓度(20 mg/L)胁迫组分别随机取出3只蟹,冰冻麻醉后解剖取出鳃、胃、肝胰腺。一部分样品用Bouin′s液固定,石蜡包埋,切片厚6—7 μm,苏木精-伊红染色,Nikon E1000显微镜观察、拍照。另取一部分样品用2.5%戊二醛预固定(4 ℃),1%锇酸后固定,梯度乙醇脱水,Epon812环氧树脂包埋。LKB-Nova超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染色,日本电子JEM-1200EX型透射电镜观察、摄影。

1.4 数据分析

所测数据采用SPSS16.0软件进行统计分析,进行单因子方差分析(One-Way ANOVA),LSD(Least Significant Difference)多重比较和Duncan检验。显著水平设为P<0.05。

2 结果与分析 2.1 氨氮对日本蟳DHC和血蓝蛋白含量的影响

图 1可以看出,在氨氮胁迫下,各实验组DHC均呈“先升后降”的趋势。处理第1天,实验组DHC均显著高于对照组,以中浓度组DHC上升较快,在胁迫1 d时即已升至最大值,随后逐渐下降。低浓度组DHC于处理第3天升至最大值,其中5 mg/L组DHC升高幅度最大,为对照组的4.18倍。高浓度组DHC上升较慢,于处理第5天升到最大值。处理第15天,15和20 mg/L组DHC显著低于对照组,DHC与氨氮胁迫浓度呈显著负相关(r=-0.931,P<0.01)。

图 1 氨氮胁迫对日本蟳DHC的影响 Fig.1 Effect of ammonia-N stress on DHC in Charybdis japonica 上标不同小写字母表示同一测试时间不同处理组间差异显著(P<0.05)

图 2可知,在氨氮胁迫第1天,各实验组血蓝蛋白含量均显著高于对照组。中浓度组于处理第1天,血蓝蛋白含量升至最高,随后呈下降趋势。2 mg/L组上升速度较慢,于处理第5天升至最大值,5和20 mg/L两组均于处理第3天升至最高。处理第10天,各实验组血蓝蛋白含量均出现下降,但仍显著高于对照组。至处理第15天,各实验组血蓝蛋白含量与对照组差异均不显著(P>0.05)。

2.2 氨氮胁迫对日本蟳PO和LSZ活力的影响

图 3所示,在氨氮胁迫下,除20 mg/L组外,其他实验组PO活力均先升后降。处理第1天,除20 mg/L组PO活力明显低于对照组外,其他实验组PO活力均有显著上升,以15 mg/L组上升最快。处理第3天,15 mg/L组PO活力有所下降,而其他实验组PO活力升至最大值,上升幅度以10 mg/L组最大,20 mg/L组为最小。随着处理时间的延长,各实验组PO活力均呈下降趋势。至处理第15天,胁迫浓度10 mg/L及以上组PO活力明显低于对照组,且PO活力与氨氮胁迫浓度呈显著负相关(r=-0.965,P<0.01)。

图 2 氨氮胁迫对日本蟳血蓝蛋白含量的影响 Fig.2 Effect of ammonia-N stress on hemocyanin content in Charybdis japonica
图 3 氨氮胁迫对日本蟳PO活力的影响 Fig.3 Effect of ammonia-N stress on PO activity of Charybdis japonica

图 4可见,在氨氮胁迫下,实验组LSZ活力呈现3种变化规律:浓度在10 mg/L及以下组LSZ活力先升后降;15 mg/L组LSZ活力在处理第1天出现下降,于第3天略有升高,随后呈下降趋势;高浓度组LSZ活力持续下降。低浓度组LSZ活力于处理第5天升至最高,而中浓度组LSZ活力最大值出现在处理第3天,升高幅度以5 mg/L组最大。处理第15天,各实验组LSZ活力均低于对照组,且LSZ活力与氨氮胁迫浓度呈显著负相关(r=-0.986,P<0.01)。

图 4 氨氮胁迫对日本蟳LSZ活力的影响 Fig.4 Effect of ammonia-N stress on LSZ activity of Charybdis japonica
2.3 氨氮胁迫对日本蟳SOD活力、CAT活力和MDA含量的影响

图 5可以看出,在氨氮胁迫下,各实验组SOD活力均为先升后降。低浓度组SOD活力上升较慢,2 mg/L组SOD活力于处理第5天升至最大值,随后下降。随着胁迫浓度的升高,各实验组SOD活力的上升速度也随之加快,5、10和15 mg/L三组SOD活力于处理第3d升至最高值,升高幅度以15 mg/L组最大。20 mg/L组SOD活力于处理第1天即升至最高值,但升高幅度较小。至处理第15天,除2 mg/L组外,其他实验组SOD活力均显著低于对照组(P<0.05),且SOD活力与氨氮胁迫浓度呈显著负相关(r=-0.983,P<0.01)。

图 5 氨氮胁迫对日本蟳SOD活力的影响 Fig.5 Effect of ammonia-N stress on SOD activity of Charybdis japonica

在氨氮胁迫下,各实验组CAT活力亦呈现“先升后降”的变化规律(图 6)。处理第1天,各实验组CAT活力均高于对照组,以20 mg/L组上升幅度较大。处理第3天,5和10 mg/L两组CAT活力升至最大值,而15和20 mg/L两组出现下降。处理第5天,2 mg/L组CAT活力升至最高,其他实验组均下降。处理第10天,各实验组CAT活力均低于对照组,除2 mg/L组外均差异显著。至处理第15天,各实验组CAT活力继续下降,CAT活力与氨氮胁迫浓度呈显著负相关(r=-0.972,P<0.01)。

图 6 氨氮胁迫对日本蟳CAT活力的影响 Fig.6 Effect of ammonia-N stress on CAT activity of Charybdis japonica

图 7可见,在氨氮胁迫下,各实验组MDA含量呈现两种变化模式:低浓度组为“先升后降再升”,而高浓度组为持续上升。处理第1天,各实验组MDA含量均显著高于对照组,以10 mg/L组升高幅度最大。处理第3天,2、5和10 mg/L三组MDA含量出现下降。处理第5天,15和20 mg/L两组MDA含量显著高于对照组,且MDA含量与剂量浓度存在显著正相关关系(r=0.955,P<0.01)。处理第15天,各实验组MDA含量均高于对照组,除2 mg/L组外差异均显著(P<0.05)。

图 7 氨氮胁迫对日本蟳MDA含量的影响 Fig.7 Biplotgmitesaustralis Effect of ammonia-N stress on MDA content of Charybdis japonica
2.4 氨氮胁迫对日本蟳主要器官结构的影响

日本蟳的鳃由鳃壁和鳃腔组成(图 8-1),鳃壁由外到内可分为几丁质膜、上皮细胞层和基膜,鳃腔中流动着血淋巴。对照组(图 8-1,3)的鳃几丁质膜可分为内外两层,其中外层较厚且电子密度较低,内层薄而致密,紧密贴于鳃上皮的游离面。鳃上皮为单层柱状,上皮细胞排列整齐。胞质中含丰富的线粒体和质膜内褶等结构,核内染色质均匀分布。鳃腔中血淋巴丰富。在氨氮胁迫下,鳃结构呈现显著变化(图 8-2,4)。几丁质膜外层显著变薄,电子密度增大并出现纵纹,局部有断裂现象。鳃上皮细胞形状不规则、排列紊乱。胞质中线粒体、质膜内褶等细胞器减少,电子密度降低。核形状不规则,局部核膜出现缢缩,核内染色质呈异固缩状态。鳃腔中血淋巴减少,密度降低,血细胞出现凝集现象。

日本蟳血细胞可分为无颗粒细胞、小颗粒细胞、中间型细胞和大颗粒细胞等4种类型[16]。对照组鳃腔中的血细胞质膜完整,形成丰富的伪足,胞质中颗粒明显,内质网、线粒体等细胞器结构正常,并有少量的液泡(图 8-5)。在氨氮胁迫下,血细胞中出现大量的空泡(图 8-6,8),内质网、线粒体等细胞器减少,伪足不明显。中间型细胞内出现较多的残余体结构,部分颗粒破碎(图 8-7)。无颗粒细胞质膜多处破裂,核异固缩,形状不规则(图 8-8)。

图 8 氨氮胁迫下日本蟳鳃与血细胞的结构变化 Fig.8 Ambient ammonia stress on the structure of gills and hemocytes in Charybdis japonica 1: 对照组鳃显微结构;2: 氨氮胁迫下鳃显微结构:几丁质膜断裂,鳃腔变小,血淋巴减少,血细胞凝集;3: 对照组鳃超微结构;4: 氨氮胁迫下鳃超微结构:鳃上皮排列紊乱,染色质异固缩;5: 对照组血细胞超微结构;6—8: 氨氮胁迫下血细胞超微结构:6: 大颗粒细胞空泡化;7: 中间型细胞胞质中出现残余体;8: 无颗粒细胞严重空泡化,核膜缢缩,染色质异固缩;bm:基膜;C:几丁质膜;E:上皮;H:鳃腔;hc:血细胞;ig:中间型细胞;il:内层;lg:大颗粒细胞;N:细胞核;ol:外层;pmi:质膜内褶;rb:残余体;sg:小颗粒细胞;V:空泡

日本蟳肝胰腺结构与其他十足类[17]一致,为复管状腺,其腺上皮包含4类细胞:分泌(B)细胞、吸收(R)细胞、纤维(F)细胞和胚(E)细胞(图 9-1)。对照组腺上皮为单层柱状,排列整齐,各类细胞特征明显:B细胞游离面不规则;R细胞呈嗜酸性,胞质内有脂肪滴;F细胞为强嗜碱性,电镜观察可见丰富的糙面内质网与核糖体(图 9-3)。在氨氮胁迫下,腺上皮形态不规则,排列紊乱,B细胞减少,腺腔中出现细胞碎片(图 9-2)。腺细胞内出现大量空泡,有些细胞大半体积甚至整个细胞都呈空泡状(图 9-4)。F细胞内质网、核糖体等细胞器减少,核内染色质凝聚。

日本蟳胃粘膜上皮为单层柱状上皮,对照组胃上皮排列整齐,其游离面覆盖着几丁质膜(图 9-5)。与鳃相同,胃几丁质膜也可分为外层和内层,内层与胃上皮游离面紧密相接,连接面平整。胃上皮胞质中含有丰富的糙面内质网和核糖体(图 9-7)。在氨氮胁迫下,胃几丁质膜外层局部断裂,内层与胃上皮连接面呈锯齿状。胃上皮排列不规则,染色变浅,基膜变薄且不连续(图 9-6)。胃上皮细胞中出现大量的残余体,内质网等细胞器显著减少(图 9-8)。

3 讨论 3.1 氨氮胁迫对日本蟳免疫生理指标的影响

甲壳动物为非特异性免疫,其细胞免疫体现为血细胞对病原体的吞噬、包掩和凝集等作用,而体液免疫是通过血细胞被激发释放出酚氧化酶、溶菌酶、抗氧化酶等多种免疫因子于血浆中而实现[18],常将血细胞数量作为衡量甲壳动物免疫水平的一个重要指标[19]。黄鹤忠等[20]报道中华绒螯蟹在氨氮(5 mg/L)胁迫10 d时,DHC下降39.74%;而凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[21]在氨氮浓度为5.24 mg/L的水体中暴露7 d,其DHC无显著变化。本实验结果显示,日本蟳在氨氮胁迫处理15 d时,低浓度组(2和5 mg/L)DHC略高于对照组,而高浓度组(15和20 mg/L)DHC显著低于对照组,表明低浓度氨氮胁迫下,日本蟳机体处于持续应激状态,DHC较高,而当胁迫超过一定阈值时,会造成机体不可逆转的损伤[22],导致胁迫初期短暂出现DHC升高的应激反应后迅速下降。不同动物对氨氮胁迫所表现出DHC的不同响应与其对氨氮耐受能力有关。

图 9 氨氮胁迫下日本蟳肝胰腺与胃的结构变化 Fig.9 Ambient ammonia stress on the structure of hepatopancreas and stomach in Charybdis japonica 1: 对照组肝胰腺显微结构;2: 氨氮胁迫下肝胰腺显微结构:腺上皮形态不规则,排列紊乱,腺腔中出现细胞碎片,胞质内含大量空泡;3: 对照组F细胞超微结构;4: 氨氮胁迫下腺上皮超微结构:腺上皮严重空泡化,染色质异固缩;5: 对照组胃显微结构;6: 氨氮胁迫下胃显微结构:几丁质膜外层局部断裂,内层与胃上皮连接面呈锯齿状,胃上皮排列不规则;7: 对照组胃上皮细胞超微结构;8: 氨氮胁迫下胃上皮超微结构:胞质中出现大量残余体; bc:B细胞;bm:基膜;C:几丁质膜;E:上皮;fc:F细胞;gc:腺腔;il:内层;N:细胞核;ol:外层;rc:R细胞;rb:残余体;RER:糙面内质网;V:空泡

血蓝蛋白是甲壳动物血淋巴中的呼吸色素,参与免疫、渗透压维持及蜕皮等多种生命活动[23]。Chen等[24]发现水体中氨氮浓度升高会造成日本对虾(Penaeus japonicus)血蓝蛋白浓度下降。本实验中,在氨氮胁迫下,日本蟳血蓝蛋白含量先升后降,至处理后期,20 mg/L组血蓝蛋白含量下降明显。胁迫初期血蓝蛋白含量的升高可能与机体应激反应时耗氧量增加有关,而高浓度氨氮胁迫会影响ATP 酶活性,氨氮分泌受抑制,血淋巴中氨氮浓度明显增高,导致pH值上升,血蓝蛋白降解[25]

酚氧化酶原系统和LSZ是甲壳动物重要的血淋巴免疫应答因子。已有研究表明,在适量外源刺激或胁迫下,颗粒细胞通过胞吐作用释放酶原于血浆中并激活,免疫力增强[26],而LSZ是一种碱性蛋白,可裂解微生物细胞壁,具有重要的防御功能[27]。据姜令绪等[28]报道,凡纳滨对虾在氨氮(0.5—2.5 mg/L)胁迫2 d内,随着氨氮浓度升高,PO活力升高,而LSZ活力下降。黄鹤忠等[20]研究显示,中华绒螯蟹在1 mg/L的氨氮下处理20 d时,PO活力高于对照组,但LSZ活力较低,浓度在2 mg/L以上的氨氮胁迫会造成PO活力下降。本实验结果与之相近,日本蟳在2 mg/L氨氮胁迫15 d时,与对照组相比,PO活力略高,LSZ活力略低。表明低浓度的氨氮刺激会激活酚氧化酶原系统,使PO活力升高,而高浓度的氨氮胁迫下,虽然PO活力随着机体应激反应而出现一定上升,但高浓度氨氮的持续作用会造成酚氧化酶原系统进一步的的合成或释放受阻,PO活力随之下降。LSZ活力对不同浓度氨氮胁迫的响应较复杂,低浓度氨氮的长期胁迫与高浓度氨氮的短期胁迫对日本蟳LSZ活力均有抑制效应,表明LSZ较PO对氨氮胁迫更为敏感。

SOD和CAT是生物体抗氧化防御系统的关键酶,SOD能催化O-2生成H2O2,而CAT可催化H2O2生成H2O和O2,防止过多的活性氧积存对机体造成氧化损伤[29]。MDA是机体内脂质过氧化反应的重要产物,能引起蛋白质分子内与分子间交联,导致细胞损伤[30]。本研究中,在氨氮胁迫初期,各实验组SOD与CAT活力均高于对照组,且酶活升高幅度与胁迫程度呈正相关,表明氨氮胁迫对日本蟳SOD与CAT活力有明显的诱导效应,与洪美玲等[4]对中华绒螯蟹的研究结果一致。氨氮胁迫会造成机体内产生大量的活性氧自由基,SOD和CAT活力的迅速升高可以保护机体免受自由基的伤害。随着氨氮胁迫时间的延长,SOD和CAT活力在升高后呈现下降趋势,且酶活力与氨氮胁迫浓度呈显著负相关,而MDA含量与胁迫浓度呈显著正相关,表明氨氮的长期胁迫会破坏抗氧化系统,导致机体清除自由基能力降低,过多的活性氧使机体脂质过氧化程度加剧,MDA含量随之增加。实验中SOD活力和CAT活力的变化表现出非同步性,表明两者在功能上具有相对的独立性,可能与“CAT底物H2O2除了由SOD催化O-2的歧化反应获得外,亦可从氨基酸或细胞色素P450酶系激活产生”[31]有关。本实验中,MDA含量与SOD活力呈极显著负相关,可将SOD活力和MDA含量的长期变化情况配合用于评价氨氮胁迫下日本蟳的免疫状态。

3.2 氨氮胁迫对日本蟳器官结构的影响

甲壳动物的鳃具有呼吸、排泄及渗透压调节等多种功能,因其与水体直接接触,又是阻挡病原侵袭的第一道防线,易受到环境的影响及病害的侵袭。Chen等[24]发现氨氮会破坏日本对虾鳃组织,降低血淋巴输送氧气功能。本实验光镜及电镜结果显示,高浓度氨氮胁迫对日本蟳鳃结构影响显著:几丁质膜变薄、局部断裂,鳃上皮排列紊乱、细胞器和质膜内褶减少,鳃腔狭窄、血淋巴减少,与吕晓燕等[32]对亚硝酸盐胁迫下红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)鳃结构的观察结果相近。覆盖在鳃上皮游离面的几丁质膜是阻止病原侵蚀的屏障[33],几丁质膜的破坏将导致机体容易感染病原。质膜内褶膜上富有Na+、K+-ATP酶,与离子转运有关[34],质膜内褶的减少会影响渗透压调节。鳃腔变得狭窄和血淋巴的减少会严重影响鳃的呼吸功能。

甲壳动物血细胞除了与呼吸有关外,还担负着机体防御保卫功能。王玥等[35]报道氨氮胁迫会导致罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)血细胞粗面内质网、核糖体和线粒体数量减少。本文超微结构观察结果与之一致,在氨氮胁迫下,血细胞中细胞器减少、空泡化严重,表明血细胞合成免疫因子的能力下降;伪足的减少表明其吞噬功能降低;染色质的异固缩和基因转录活性丧失有关,直接影响到免疫相关基因的表达[36]

通常认为甲壳类肝胰腺中R细胞具有细胞内消化及储存脂肪的功能,F细胞含有发达的糙面内质网与核糖体,主要功能是合成和分泌消化酶,进行细胞外消化,而B细胞具有细胞内消化和分泌的功能[37]。已有研究表明,亚硝酸盐胁迫和锌胁迫会分别导致红螯光壳螯虾[32]和中华绒螯蟹[38]肝胰腺细胞的空泡化。本实验结果中,氨氮胁迫造成日本蟳肝胰腺上皮排列紊乱,腺腔中甚至出现细胞碎片,表明其组织结构损害明显,消化功能受到影响。R细胞严重空泡化,势必影响到其细胞内消化功能;F细胞空泡化,内质网、核糖体减少,核内染色质凝聚,对消化酶的合成产生显著影响。本实验中发现氨氮胁迫导致B细胞减少的现象和洪美玲等[4]对中华绒螯蟹的研究结果一致。一般认为甲壳类B细胞由F细胞分化形成[39],氨氮胁迫在影响到F细胞合成消化酶功能的同时,也影响其进一步的分化,所以导致B细胞减少。

蟹类贲门胃由发达的几丁质膜形成齿和嵴突,构成胃磨,对食物进行研磨;而幽门胃的几丁质特化形成刚毛,构成过滤器,可对研磨后的食物进行过滤[34]。关于氨氮胁迫对蟹类胃结构的影响尚未见报道。本研究发现,氨氮胁迫可导致日本蟳胃壁几丁质膜变形,局部断裂,会对其研磨、过滤的功能产生影响。崔龙波等[40]报道日本蟳幽门胃上皮具有一定的消化酶活性,本实验通过透射电镜也观察到胃上皮胞质中含有丰富的糙面内质网和核糖体,表明其具有较强的合成功能,而氨氮胁迫导致胃上皮内质网显著减少,代之以大量的残余体,表明其合成功能受到较大的影响。

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