苦丁茶树，即粗壮女贞(Ligustrum robustum)，为木犀科女贞属植物，是一种野生的常绿灌木或小乔木，集中分布在贵州、四川、云南等南方地区，分布海拔高度为400—2000m^[1]。将粗壮女贞鲜叶加工后作为一种代茶饮料，称为苦丁茶，加工而成的苦丁茶经冲泡，叶片舒展鲜活，汤色翠绿，滋味先苦后甘，具有清热解毒、生津止渴、降脂减肥和防癌治癌等多种药理保健功效^{[2, 3, 4]}，享有“青山绿水”和“绿色黄金”的美誉^[5]。苦丁茶树作为极具开发潜力的经济类植物，受到研究者广泛关注，目前主要研究集中在药理及其成份提取、分析^[2]等方面，在产量^[6]、光合特性^{[7, 8]}、微量元素^{[9, 10]}、人工繁殖与栽培技术^[11]、生理特性^[12]、有机肥^[13]等方面也有研究。

目前，在我国西南地区已开始大力发展苦丁茶产业，对地区经济发展起到了很好的带动作用。然而，有研究者发现苦丁茶树虽在无遮荫或强光照条件下可正常生长，但强光照会使叶面出现皱纹，叶片两侧向中间闭合，呈卷曲状^[1]，影响茶叶产量和品质。另一方面，随着全球气候变暖，近年来西南地区高温干旱形势逐渐加剧，这对苦丁茶树生理适应产生了影响，导致其产量和品质下降。叶片是植物接受光的器官，光照条件的改变首先会影响到叶片生长发育和形态解剖结构的变化^[14]，随着叶片组织结构的变化，植株光合特性也发生相应变化(如净光合速率提高、光补偿点和饱和点降低等)^{[15, 16, 17, 18]}。前人研究得出遮荫措施可通过降低光照强度、气温、土温和叶温等来提高土壤含水量、空气湿度等^{[15, 19]}改变植物生长环境，进而植物叶片栅栏组织、海绵组织、叶角质层、表皮细胞和叶厚度等均会随着遮荫强度的变化发生相应变化^{[20, 21, 22]}。因此，采取合理的遮荫措施对提高苦丁茶产量和品质，以及在西南地区或更广泛的地区栽培具有重要意义。但是，目前有关苦丁茶树在遮荫条件(或不同光照强度)下叶片生长及光合特性的详细和系统性研究尚未见报道，且在苦丁茶树栽培和管理过程中还没有遮荫操作的理论数据支撑。

因此，本文采用人工遮荫的方法，对不同遮荫强度下苦丁茶树叶片生长及光合特性进行系统研究，目的是(1)揭示不同光照强度对苦丁茶树叶片生长和光合能力产生的影响及其适应特征；(2)明确能够促进苦丁茶树叶片生长、提高光合能力和茶叶产量的适宜光照范围。从而为苦丁茶树高产、优质的合理栽培，抚育管理技术提供理论依据。

试验在贵州大学林学院苗圃进行，地处贵阳市花溪区，东经104°34′、北纬26°34′，年均温度15.8 ℃；年降水量为1229 mm；年平均相对湿度79%，年生长期为271 d。供试材料为生长状况基本一致的3年生苦丁茶树实生苗，栽于高22 cm、口径28 cm、底径22 cm花盆中，每盆一株。

自2009年11月份用不同透光率的黑色遮荫网进行遮荫处理，遮荫棚南北向，高1. 5 m，宽2. 0 m，东、西遮荫网距地面0 cm，南北敞开，便于通风透气。通过增加遮荫网的层数来调整遮荫程度，并用照度计精确测定。设置遮荫梯度分别为: 20%、40%、60%，以全光照作为对照(CK)，每处理重复3次，每重复4株。并在多个晴朗无云天每隔2 h对不同遮荫处理的实际光照强度进行了测定(图 1)。为避免相互遮光，各处理设置2.0 m的间距，所有供试植株均按一致的常规栽培技术管理。试验相关指标的测定于2010年5月之后展开，且测定和取样期间各处理均继续保持遮荫至试验完毕。

图 1 不同遮荫处理下光合有效辐射值 Fig. 1 Light density in different shade treatments

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于2010年6月初开始观测叶片、枝条等形态特征以及新梢性状、色泽等，月末在各处理中摘取一定量的成熟叶片进行叶长、叶宽和叶面积测定。沿叶主脉两侧切取0. 5—1 cm的小片，用FAA液固定、梯度酒精脱水、番红染色、二甲苯透明处理制成石蜡切片(厚度为10 μm)，脱蜡后固绿染色剂进行复染，在Motic型光学显微镜下，用Images Advaced3.0软件进行观测。

在光合特性测定完成后，摘取各处理叶片，精确称取0. 300 g苦丁茶树鲜叶片，测定采用95%乙醇提取比色法，每个样品重复3次。

于2010年6月中旬选择晴朗无云天用LI-6400进行光合日进程的测定。测定因子有：净光合速率(Pn)、气孔导度(Cond)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO₂浓度(Ci)、叶面蒸汽压亏缺(Vpdl)等。测定时间为08:00—18:00，每2 h测1次，每个处理测定3株，每株测定3—5片叶子，重复记录10个观测值，取其平均值作为该处理此时刻的光合速率测定值。

于2010年6月中旬选择晴朗无云天气，在9:00—11: 00或14:00—16:00进行光合响应曲线的测定。光合光响应曲线的测定用LI-6400-02B红蓝光源设定叶室中光合有效辐射强度分别为: 2000、1800、1600、1500、1400、1300、1200、1000、800、600、400、200、100、50、20、0 μmol · m^-2 · s^-1，叶室温度控制在(25 ±0.5) ℃; 相对湿度控制在(40 ±5)%，测定前对叶片进行1000 μmol · m^-2 · s^-1光诱导15 min。

用LI-6400测定初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)，最大的光化学效率(Fv /Fm)、按照Fv /Fm=(Fm-Fo) /Fm来计算。其中Fo、Fm测定前，需要植物叶片完全的暗适应。选定叶片后，白天用锡纸包裹，经过一个晚上的暗适应后在凌晨破晓前测定。

采用SPSS 20.0 软件对试验数据进行One-way ANOVA 分析，Duncan 新复极差法进行多重比较。对光响应测定结果，按非直角双曲线方程对光响应参数进行估算^[18]：不同遮荫强度下的Pn-PAR响应曲线采用非直角双曲线模型进行拟合，并通过直线回归得光补偿点(LCP)、光饱和点(LSP)、最大净光合速率(Pn_max)、表观量子效率(AQY)、暗呼吸速率(R_d)等。

由表 1可知，遮荫对苦丁茶树叶片外观形态产生的影响主要表现在随着遮荫强度的增加，苦丁茶树叶片叶色加深、叶型呈长椭圆形或椭圆形、新梢色泽深绿微紫、叶缘逐渐平展、叶尖为渐尖；而遮荫对苦丁茶树姿、叶面、叶质和叶基无影响。

从表 2可见，遮荫对苦丁茶树叶长和叶面积产生了极显著影响。与全光照相比，40%和60%遮荫条件下苦丁茶树叶面积均大于无遮荫条件，但60%遮荫与无遮荫条件之间差异不显著，20%遮荫显著降低了叶面积，由此表明，适度遮荫增大了苦丁茶树叶面积，有利于苦丁茶树叶片的生长发育，而过度遮荫起到了相反的作用。

4个遮荫强度下苦丁茶树叶片上、下表皮细胞厚度分别为22.29—17.37 μm、14.47—10.42 μm，海绵组织厚度为92.77—72.62 μm，栅栏组织1—2层，厚度为64.70—48.91 μm。方差分析表明，各遮荫处理下苦丁茶树叶片海绵组织和栅栏组织的厚度存在显著差异，而上、下表皮细胞厚度差异不显著。其中，40%遮荫下叶片和栅栏组织厚度显著高于其它3个处理，栅栏组织层数为2层(表 3)，表明在40%遮荫条件下可显著改变苦丁茶树叶片解剖结构。

苦丁茶树叶片总叶绿素、叶绿素a、b含量在遮荫条件下均显著高于全光照条件下的含量(P<0.05)，且随遮荫强度的增大叶绿素含量呈上升趋势。而叶绿素a/b的值则呈相反的趋势 (表 4)。这表明，随着遮荫程度的提高， 苦丁茶树叶绿素含量的增加主要体现为叶绿素b含量的增加，即遮荫更有利于促进苦丁茶树叶片中叶绿素b的合成。

如图 2，4种遮荫强度下苦丁茶树叶片在晴天Pn日变化均呈典型的“单峰”型曲线。有遮荫的处理在10:00左右达到高峰，然后持续下降，至18:00左右降至最低点，而全光照下Pn在14:00左右才达到高峰值。4种处理下苦丁茶树叶片Pn日均值大小依次为：遮荫40%>0%>20%>60%。与40%遮荫处理相比，0%、20%和60%遮荫处理的Pn日均值分别下降了12.87%、15.56%和16.77%，达到显著水平(P<0.05)，与全光照相比，40%遮荫处理可显著提高苦 丁茶树叶片净光合速率，而20%和60%遮荫处理却起了抑制作用，但差异不显著(表 5)。

图 2 遮荫对苦丁茶树净光合速率的影响 Fig. 2 The effects of shades on diurnal net photosynthetic rate of Ligustrum robustum

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由图 3可知，4种遮荫处理Cond日变化趋势大致相同，均呈单峰曲线，从08:00开始上升，12:00左右达到最高峰， 18:00左右降至最低点。遮荫40%的处理Cond日均值分别比遮荫20%、60%和0%的处理增加了17.09%、56.19%和105.98%(P<0.05)。

图 3 遮荫对苦丁茶树气孔导度的影响 Fig. 3 The effects of shades on stomatal conductance of Ligustrum robustum

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不同遮荫强度下Tr日变化趋势与Pn一致(图 4)，都为“单峰”型曲线，其峰值出现在14:00。各遮荫强度下苦丁茶树Tr日均值大小依次为：遮荫40%> 20%>0%>60%。从表 6中Pn与其他光合因子相关性分析可知：在20%和60%遮荫条件下，Cond与Pn呈负相关，40%遮荫下则为显著正相关；4个遮荫强度下Tr与Pn均为正相关，其中40%和60%遮荫时达到显著水平(P＜0.05)。

图 4 遮荫对苦丁茶树蒸腾速率的影响 Fig. 4 The effects of shades on transpiration rate of Ligustrum robustum

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4种遮荫强度下苦丁茶树叶片Ci日变化均为“W”型，最大值均出现在18:00。在10:00—12:00， 遮荫20%、40%、60%的处理Pn下降，而其Cond、Ci 上升，因此判断苦丁茶树叶片正午Pn降低是由非气孔因素引起的(图 2、图 3、图 5)。 全光照、20%和60%遮荫条件下Ci与Pn呈负相关，但只在60%遮荫条件下达到显著水平(P＜0.05)，可见，过度遮荫导致光合有效辐射显著减少、气孔导度低、CO₂同化率低、致使较多CO₂滞留胞间、胞间CO₂浓度增高和Pn下降，故Ci是制约苦丁茶树叶片Pn的主要因素之一(表 6)。

图 5 遮荫对苦丁茶树胞间CO2浓度的影响 Fig. 5 The effects of shades on internal carbon dioxide concentration of Ligustrum robustum

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不同遮荫强度下苦丁茶树Vpdl日变化趋势均为“单峰”型曲线，峰值出现在16:00，Vpdl的大小依次为：遮荫0%>60%>40%>20%(图6)。全光照、20%、40%遮荫处理Pn与Vpdl正相关但不显著，60%遮荫处理Pn与Vpdl呈显著负相关(P＜0.05)(表 6)。

图6 遮荫对苦丁茶树叶片蒸汽压亏缺的影响 Fig. 6 The effects of shades on Vapor pressure deficit of Ligustrum robustum

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不同遮荫强度下苦丁茶树叶片Pn_max、AQY、LCP、LSP、R_d的变化见表 7，结果表明：苦丁茶树叶片在遮荫40%条件下Pn_max最大，而遮荫达到60%时Pn_max显著降低，全光照和20%遮荫处理之间差异不显著。遮光后LCP值均低于全光照，随着遮荫强度的增强呈持续下降趋势， 60%遮荫处理下LCP由全光照的41.1 μmol · m^-2 · s^-1降低到16.2 μmol · m^-2 · s^-1，下降了60.58%(P＜0.05)。遮光后叶片需光特性的变化与弱光条件相适应，改变了叶片的结构与生理功能，说明苦丁茶树在低光照条件下可通过大幅降低LCP、LSP以提高对弱光的利用能力，适应弱光环境来维持植株的正常生长。4种遮荫强度下，遮荫40%条件下苦丁茶树叶片AQY最大(0.0423)(P＜0.05)，说明其利用弱光的能力最强。

与全光照相比，遮荫降低了苦丁茶树叶片Fv/Fm和Fv/Fo值，随着遮荫强度的增加， 3种遮荫条件下Fv/Fm依次下降了2.71%、 4.59%和8.03%，Fv/Fo值依次降低了6.89%、11.99%和19.81%(P<0.01)。当遮荫达到60%时，Fv/Fm和Fv/Fo值与CK处理达到显著差异(P＜0.05)。以反映PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在活性或电子传递效率(Fv/Fo)的两个参数来分析，遮荫降低了苦丁茶树叶片叶绿素分子捕获激发能的效率及光系统Ⅱ (PSⅡ)潜在活性，且降低程度随遮荫强度的增强而增加(表 8)。

叶片是对环境变化较敏感、且变异性和可塑性大的器官^{[19, 23]}。苦丁茶树的叶片不仅是收获的主要部分，同时也是进行光合和呼吸作用等生理代谢活动的重要器官^[24]。因此，叶片内部结构常作为评价苦丁茶树生理活性、抗逆性以及产量、品质的指标的重要依据^[25]。栅栏组织第一层细胞数及厚度与光合强度有密切关系，叶片解剖结构特征可作为间接鉴定光合作用生产力的指标，栅栏组织厚度越大其生产力指数就越大^[26]。本研究得出40%遮荫条件下叶片和栅栏组织厚度均显著高于其它3个处理，说明苦丁茶树在40%遮荫时可通过增加叶片厚度，促进叶片吸收更多的光，弥补遮荫造成的光照强度不足，从而提高叶片的光能利用率^{[19, 27]}。另外，苦丁茶树在遮荫条件下增加了叶绿素b的含量，因叶绿素b在蓝紫光部分的吸收带较宽，耐荫植物可利用蓝紫光在低光照下正常生长^[28]，这也是苦丁茶树在光胁迫环境下所形成更耐弱光的一种生理适应，为光合作用的需要尽可能地吸收较多的光。上述分析表明，40%遮荫条件可有效促进苦丁茶树叶片的生长，使苦丁茶树叶片整体的生长发育最好，且生产力指数最大。

Poorter等认为植物蒸汽压亏缺可能比高温和高光照造成的光合“午休”对光合作用的影响还要明显^[29]。本研究中，60%的过度遮荫使苦丁茶树叶片Pn显著低于其它处理，其Pn与Vpdl呈显著负相关，而与Tr呈显著正相关，这是因为当蒸汽压亏缺增大时，植株大量失水导致细胞水势下降，蒸腾速率降低^[30]，蒸腾速率的降低影响矿质元素和水的吸收，进而影响光合作用的进行。同时，蒸腾速率降低使得光合产物输出变慢，产生反馈抑制，也会降低光合速率^[19]。因此可以推断过度遮荫导致苦丁茶树叶片光合能力下降的主要因素是叶片蒸汽压亏缺增大和蒸腾速率降低所造成的。

表观量子效率是光合作用中光能转化效率的一种量度，可以正确地反映光合机构的机能变化，也可以反映叶片对弱光的利用能力^[31]。本研究中遮荫40%处理的AQY最大(0.0423)，而全光照下苦丁茶树的AQY(0.0195)却低于自然条件下一般植物的表观量子效率(0.03—0.05)^[18]。表观量子效率越大，植物吸收与转换光能的色素蛋白复合体可能越多，利用弱光能力越强^{[19, 32]}，说明遮荫40%处理使得苦丁茶树叶片吸收与转换光能的色素蛋白复合体增加，从而有效增强其利用弱光的能力，并提高光合速率。

叶绿素荧光是光合作用的探针，可真实而准确地揭示遮光对植物叶片Pn的影响机制^[33]。本研究中随着遮荫程度的增加，Fv/Fm和Fv/Fo均降低，Fv/Fm反映最大PSⅡ的光能转换效率，非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降^{[34, 35]}，Fv/Fm下降是光抑制的重要特征，在有些植物中，Fv/Fm的下降可能是一种光抑制保护机制，而不会导致PSⅡ的伤害^[36]。苦丁茶树在60%遮荫处理下各叶绿素荧光参数值显著低于其它3种处理，说明过度遮荫时，苦丁茶树叶片叶绿素分子捕获激发能的效率及光系统Ⅱ (PSⅡ)潜在活性降低，这可能是苦丁茶树叶片对遮荫后弱光的一种适应性调节。

综上所述，在苦丁茶树栽培和抚育管理中，应将栽培管理措施与其生长及生理特性结合起来，才能创造苦丁茶树的最佳生长环境，从而有效提高苦丁茶的产量和品质，建议在苦丁茶树的栽培及抚育管理技术中应以40%的遮荫强度(日光合有效辐射在273—1222 μmol · m^-2 · s^-1范围内)为最佳条件，即可通过稀植间种玉米等高秆作物或果树，达到经济和生态效益的双赢。