文章信息
- 林健, 刘文波, 孟昭军, 严善春
- LIN Jian, LIU Wenbo, MENG 1haojun, YAN Shanchun
- 缓释单萜类挥发物对落叶松毛虫行为及落叶松主要防御蛋白的影响
- Monoterpene volatiles affecting host selection behavior of Dendrolimus superans and the activities of defense protein in larch needles
- 生态学报, 2014, 34(11): 2978-2985
- Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(11): 2978-2985
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201309172294
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文章历史
- 收稿日期:2013-9-7
- 网络出版日期: 2014-03-07
2. 东北林业大学材料科学与工程学院, 哈尔滨 150040
2. Material Science and Engineering College, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
寄主植物挥发物在昆虫与寄主关系当中起着重要的作用,能干扰害虫对寄主的定位行为从而控制其危害。将从植物中提取和分离的挥发性生物活性物质用于害虫控制,己成为害虫综合治理的一个世界性的趋势[1]。但是这些活性物质挥发性较强,在生长季节必要时间段内,要实现对害虫危害情况的监测和诱杀,需要能够长时间释放有效成分的装置,以保证在昆虫活跃期内活性物质的缓慢释放,并且保持释放速率相对不变[2, 3, 4]。
植物的挥发性有机物(VOCs)组成丰富,根据挥发性有机物的合成途径、代谢类型和所具有的功能可分为3大类:萜类、苯基/苯丙烷类和脂肪酸衍生物。这些挥发性有机物并非均是信号物质,但只要具有传递信息并被感知的功能,就可成为信号化合物。研究发现,植物信号化合物主要是萜烯类和C6绿叶挥发物[5, 6]。虫害植物通过改变挥发物的组分和相对比例,作为信息来进行交流。很多研究是就单一的VOCs对植物防御系统的影响,也有研究表明,在植物间相互作用中是VOCs的混合组分起作用。所以,目前对于植物自身信息传递或是植物间的相互作用的研究就集中在这个问题上:到底是单独的一种VOCs起作用,还是VOCs混合物起作用[7]?
落叶松毛虫(Dendrolimus superans)是兴安落叶松(Larix gmelinii)重要的食叶害虫。落叶松在遭受落叶松毛虫取食危害后,其气味挥发物的组成及其相对比例改变很大,α-蒎烯、月桂烯和莰烯的释放量增加4—8倍[8],干扰松毛虫的产卵选择行为,降低其在落叶松上的产卵量[9]。落叶松毛虫危害后,落叶松针叶内几种主要防御蛋白的活力会显著增加[10, 11]。Baranchikov研究发现在遭受落叶松毛虫危害较重的落叶松植株针叶内α-蒎烯的含量比那些抗虫较强的植株少8倍左右,因此认为单萜缺乏是导致松毛虫大面积繁殖的原因。那么,单萜类释放量增加使落叶松减少被害的实质是什么?外源施用单萜类挥发物对落叶松能否起到保护作用?本研究在筛选出对落叶松毛虫雌成虫产卵寄主选择有活性的挥发物的基础上,将活性挥发物α-蒎烯、月桂烯和莰烯施用于健康落叶松苗木上,旨在探究确定:1)缓释处理是否会影响活性挥发物对落叶松松毛虫的嗅觉趋向和产卵寄主选择行为的作用?2)缓释处理能否延长活性物质的作用时间?3)外源施用这3中挥发物能否诱导增强落叶松针叶内抗虫相关主要防御蛋白[12, 13]的活力?能否系统诱导增强落叶松的抗虫性,是否为兴安落叶松的预警信号物质?
1 材料与方法 1.1 供试植物及昆虫4月末,将2年生的兴安落叶松苗盆栽,严格管理幼苗,避免人为机械损伤和病虫危害,选择健康、长势相似的苗木用于嗅觉、产卵试验及针叶内防御蛋白活力的测定。
落叶松毛虫蛹采自黑龙江省佳木斯市桦南县兴安落叶松林内,带回室内,待其羽化后雌雄分开备用。
1.2 供试挥发物及缓释处理本研究选取落叶松挥发物α-蒎烯、月桂烯和莰烯(哈尔滨市圣林化工有限公司,均为工业级,纯度≥90%),各配制成不同浓度,分别装入缓释瓶(北京中捷生物公司)中,挂于落叶松苗中下部,进行落叶松毛虫行为反应及产卵选择预实验,最终每种挥发物选用一种合适浓度装瓶悬挂于苗木。以在苗木上直接喷施挥发物的处理为对照,分析其缓释效果。
1.3 兴安落叶松苗处理将兴安落叶松随机分为9个处理(表 1),每处理90株。对缓释组、喷施组及空白对照组做嗅觉反应和产卵选择的预实验,并对比分析这3组对照的正式试验结果,此3组数据结果均无差异,因此结果分析中的对照均选用空白对照的数据。经对比分析这3组对照的落叶松针叶内几种主要防御蛋白活力的正式试验结果,此3组数据结果同样均无差异,结果分析中的对照选用空白对照的数据。
缓释组Slow-release group | 喷施组Volatiles group | 空白对照组 CK |
α-蒎烯挂瓶8μL/mL | α-蒎烯喷施1μL/mL | 对落叶松苗未做任何处理 |
月桂烯挂瓶10μL/mL | 月桂烯喷施1μL/mL | |
莰烯挂瓶20μL/mL | 莰烯喷施2μL/mL | |
对照1 挂瓶等量溶剂 | 对照2喷施等量溶剂 |
在处理后的第1、2、3、4、5天和第6天,进行Y管嗅觉反应试验。Y管嗅觉仪内径为5cm,夹角为75°。Y形管两侧臂依次连接大气采样仪、气味源和装有活性碳的空气过滤管。以罩着有机玻璃罩的松苗作为处理或对照气味源。当雌蛾爬至超过某臂的3cm处,并持续l min以上或到达该臂出口处者,记该蛾对该臂的气味源作出选择;雌蛾引入后5min,仍不作出选择,则结束对该蛾的行为观察,并记为不反应。每个处理3个重复,每个重复至少测2组,5头雌成虫为一组。每组测定前更换Y形管的两侧臂,以免残留的气味对结果产生影响。每个重复测定前都要更换各处理树苗及Y形管。换下的Y形管先用乙醇擦洗,再用水冲洗,晾干待用。
1.5 落叶松毛虫雌成虫对各处理苗木的产卵选择在处理后第1、3天和第5天,将松苗间隔50cm摆放到一个笼罩里,每个处理3盆。每个笼内放入羽化小于24h的30对未交尾的落叶松毛虫成虫。每个笼罩为1个重复,每个处理3次重复,即3个笼罩。隔1d调查1次,取出成虫,调查各处理树苗及网上的产卵量。每次调查后,更换各处理树苗,放入新羽化未交尾的成虫。
1.6 落叶松针叶内几种主要防御蛋白活力的测定 1.6.1 试验材料分别于处理后第1、第3天和第5天采集兴安落叶松幼苗健康针叶,每处理采集30株,每6株为一个重复,重复5次。将新鲜针叶放置于夹链袋内,低温密封保存,带回实验室,冰箱冷冻保存待用。
1.6.2 POD、CAT活性测定POD活性测定参照鲁艺芳[14]的愈创木酚法,以1 min内OD470变化0.01的酶量为1个酶活力单位(U/g鲜重)。CAT活性测定参照鲁艺芳[14]的过氧化氢氧化法,以1 min内OD240减少0.1的酶量为1个酶活力单位(U/g鲜重)。
1.6.3 PAL、PPO活性测定PAL活性测定采用苯丙氨酸比色法[15],以1 min内OD290变化0.01为1个酶活力单位(U/g鲜重)。PPO活性测定采用咖啡酸比色法[16],以1 min内OD470变化0.01为1个酶活力单位(U/g鲜重)。
1.6.4 TI、CI活性测定TI、CI活力测定参照徐伟[17]的方法,以1min内蛋白酶抑制剂活力降低0.001为1个酶活力单位(U/g鲜重)。
1.7 数据统计及分析测得数据应用Excel表格处理、绘图,SPSS17.0统计分析软件进行方差分析、差异显著性检验采用LSD方法。
2 结果与分析 2.1 落叶松挥发物缓释处理对落叶松毛虫嗅觉反应的影响1μL/mL α-蒎烯和月桂烯及挂瓶处理的落叶松对松毛虫都有显著的诱引作用,2μL/mL 莰烯及挂瓶处理对松毛虫有显著的驱避作用。
处理1d后,α-蒎烯和月桂烯对落叶松毛虫都有显著的诱引作用(P<0.01),莰烯对松毛虫有显著的驱避作用(P<0.01),喷施挥发物和缓释处理之间无显著差异(图 1)。
处理第2、3、4天,α-蒎烯和月桂烯缓释处理对松毛虫都有显著的诱引作用(P<0.01),莰烯缓释处理对松毛虫有显著的驱避作用(P<0.01)。喷施3种挥发物的落叶松与对照相比,无显著差异(P>0.05)(图 1)。
处理第5天,α-蒎烯缓释处理对松毛虫有显著的诱引作用(P<0.05),月桂烯缓释处理对松毛虫有极显著的诱引作用(P<0.01),莰烯缓释处理及喷施3种挥发物的落叶松与对照相比,均无显著差异(P>0.05)(图 1)。
处理第6天,喷施3种挥发物和缓释处理的落叶松与对照相比,无显著差异(P>0.05) (图 1)。
2.2 落叶松挥发物缓释处理对落叶松毛虫产卵选择的影响由图 2可见,落叶松毛虫在喷施α-蒎烯和月桂烯及相应的缓释处理1d后的落叶松上的产卵量明显高于对照(P<0.01),在喷施莰烯的落叶松上的产卵量明显低于对照(P<0.01)。3d后,α-蒎烯和月桂烯缓释处理落叶松上的产卵量明显高于对照(P<0.01),喷施莰烯的落叶松上产卵量明显低于对照(P<0.01),喷施3种挥发物处理上的产卵量均与对照相比无显著差异(P>0.05)。5d后,所有处理落叶松上的产卵量与对照相比无显著差异(P>0.05)。
2.3 各处理落叶松针叶内主要防御蛋白活力变化 2.3.1 各处理落叶松针叶内保护性酶活性变化由图 3可见,各处理落叶松针叶内POD和CAT活性在处理第1、3天和第5天差异不显著。
2.3.2 各处理兴安落叶松针叶内防御性酶活性变化由图 4可见,各处理落叶松针叶内PPO和PAL活性在处理第1、3天和第5天差异不显著。
2.3.3 各处理兴安落叶松针叶内蛋白酶抑制剂活性变化由图 5可见,各处理落叶松针叶内TI和CI活性在处理第1、3天和第5天差异不显著。
3 结论与讨论本研究结果表明,寄主植物上悬挂3种挥发物的缓释瓶,可以达到直接喷施挥发物的效果,即悬挂α-蒎烯和月桂烯缓释瓶对雌虫有引诱作用,悬挂莰烯缓释瓶对雌虫的有显著的驱避作用。松毛虫在喷施α-蒎烯和月桂烯的落叶松上的产卵量明显高于对照(P<0.01),在喷施莰烯的落叶松上产卵量明显低于对照(P<0.01)。缓释瓶可将α-蒎烯和月桂烯的作用时间延长至5d,将莰烯的作用时间延长至4d。以往研究表明,雌蛾选择合适的寄主植物作为产卵场所时对寄主植物挥发物有一定的偏好[18, 19],与本研究结果一致。这表明悬挂挥发物缓释瓶可以达到喷施挥发物的作用效果,并可以有效的延长挥发物的作用时间。
植物在受到外界侵害时,可以利用VOCs信号将伤害信息传递给周围植物进行防御,除健康植物可以接受VOCs建立防御外[7],害虫天敌也可以接收到信号,从而实现间接防御[20]。研究表明,植物释放VOCs信号可以系统诱导植株产生PIs实现主动防御[21]。本研究选取的3种落叶松挥发物α-蒎烯、月桂烯和莰烯,在落叶松毛虫取食后,释放量显著增加;并且POD、CAT、PPO、PAL、TI、CI都有显著的变化[17],其中PPO和PAL是植物次生物质生成过程中的关键酶,其活性的改变在一定程度上表征着植物防御体系在变化。本试验结果表明,单一施用α-蒎烯、月桂烯和莰烯不能使兴安落叶松针叶内主要防御蛋白活力改变,说明三者不是落叶松的预警信号物质,没有系统诱导改变兴安落叶松的化学防御能力,而只是改变了落叶松的气味组成,干扰了落叶松毛虫的产卵选择行为,减少了其在落叶松上的落卵量,因而降低了落叶松的被害程度。落叶松释放的VOCs信号,可能是单一物质或者是混合物起作用,这3种挥发物是否是落叶松VOCs信号物质,还需要通过研究释放VOCs的单体或突变体植株来证实[6]。
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