微生物的次生代谢产物如色素、抗生素、胞外水解酶，包括脂酶、蛋白酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶等在食品、医药、农业、化工等领域具有广泛的应用价值^{[1, 2, 3]}。在已被利用的微生物源活性物质中，放线菌来源的占70%^[4]，因而，放线菌是产生物活性物质的重要微生物类群。近年来，随着耐药病原菌增多、天然活性化合物发现速率不断降低，以及从特殊生境中寻找产新型生物活性化合物放线菌的兴起，对植物根际土放线菌多样性及其代谢产物的研究正逐渐受到人们的关注^[5]。

植物根际与其周围的土壤微域构成一个特殊的微生态环境^[6]，在此环境中，根际土微生物与植物体进行着活跃的交流：一方面植物体通过产生根际分泌物来选择性保留一些微生物，如研究发现姜黄属植物根际可分泌一种抗菌活性物质，该物质能促进其根际土放线菌的生长，而对其它土壤细菌和真菌却具有抑制性^{[7, 8]}；另一方面根际土放线菌通过将游离态的氮硫化合物(如氨、H₂S)转换为稳定的可被植物体吸收的形式，或合成一些分子物质如酶类、有机酸等，对植物体的生理代谢产生一定影响^[9]。此外，Goodfellow等^[10]研究发现，植物根际土中的放线菌可产生一些抗菌活性物质，如可降解真菌细胞壁的酶类，如几丁质酶、蛋白酶或其他抑菌化合物，从而保护植物免受病原菌的侵害；我国研究人员将从苜蓿根际土中分离获得的细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)制成“5406”抗生菌，用于保护棉花作物免受一些土壤真菌的侵害^[11]。Intra等^[12]从果园植物根际土中分离到抗炭疽病菌的放线菌，Suzuki等^[13]也发现植物根际土放线菌可产生生物活性化合物。研究还表明，植物根际土放线菌的数量是非根际土的2倍^[14]，因此，植物根际土放线菌是新型抗生素或其它生物活性物质的重要来源。

高山植物根际土放线菌不仅与其所在植物密切相关，而且因长期处于高寒、低压、缺氧、强辐射等极端恶劣环境条件下，在适应环境的过程中形成独特的生理代谢机制，具有产生特殊生物活性化合物的潜能。如张新军等^[15]在研究藏东南色季拉山海拔4000多米的高寒植物长鞭红景天根际土微生物时发现，一些根际促生菌(包括放线菌)通过产生次生代谢物如几丁质酶、酸等，使长鞭红景天能够更好的适应高海拔、低气压、高辐射、温差大的恶劣环境；在国外，有研究人员发现，美国西部高海拔2273—2364 m地区蒿属植物根际土中的一些放线菌具有广谱性抗菌活性，是新型生物活性化合物潜在产生菌^[16]。这些研究说明，高山植物根际土放线菌是特殊生物活性物质的重要来源。本文对采自祁连山老虎沟地区不同海拔的15种植物根际土样中的放线菌生态分布多样性及生理学特性进行了初步研究，其结果将为高山植物根际土放线菌资源的研究和开发利用提供科学依据。

本研究土壤样品于2010年8月采自祁连山脉西段老虎沟山区不同海拔、不同植被类型的植物根际(39°44.706′—39°29.958′ N，96°11.394′—96°31.176′ E；海拔在2200—4200 m)。研究区为典型大陆性气候，老虎沟内12号冰川是祁连山最大的复式山谷冰川，受冰川及高山环境的影响，该地区年均气温为-11.8 ℃，降水主要出现在5—9月；同时，受高海拔及地形的共同作用，老虎沟地区太阳总辐射年总量达6937.9 MJ/m²，沟内为低温多年冻土^[17]。区域内植被类型按垂直带划分，主要有荒漠化草原带、高山草原带、高山灌丛带、高山草甸带和高山寒漠带。

在上述5个不同植被类型中，于各海拔采集2—4种、共15种植物根际土样(表 1)，以供放线菌的分离分析。植物根际土样的采集参照文献^[8]进行，采用三点混合法，取样过程严格无菌操作，采样工具用过氧乙酸浸泡无菌处理，操作过程使用一次性无菌手套，并佩戴口罩以防口腔细菌污染。

15个土样风干后，于120 ℃干热1 h^{[18, 19]}，并在分离培养基中加入75 μg/mL重铬酸钾和2 μg/mL青霉素^[19]。采用甘油精氨酸培养基，稀释平板涂布法进行放线菌的分离培养，常规方法计数、纯化和保藏，以供后续分析研究。

根据形态和培养特征为主、生理生化特征为辅的原则将分离菌株鉴定至属^{[20, 21]}。

培养特征：将菌株转接至高氏一号平板培养基上，培养7、15、30 d分别记录下述特征：菌落形态、孢子堆颜色、可溶性色素颜色、气生和基内菌丝颜色。

形态特征：采用插片法，于培养7、14、21 d，分别取出盖玻片镜检，观察记录菌丝体特征。

生理生化特性测定：参照阮继生、黄英的测定方法^[21]，主要进行了明胶液化、淀粉水解、硫化氢产生等试验以对生理生化特征进行研究。

菌体总DNA的提取参照Orsini等^[22]和徐平等^[23]的方法进行，用通用引物27 f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1504 r (5′-TTAAGGATGGTGATGCCGCA-3′)扩增16S rDNA片段。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。16S rDNA扩增产物的测序由北京华大基因生物公司完成。

测序结果拼接后提交至美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLAST在线比对，疑似嵌合的序列用RDP(Ribosomal Database Project)在线Chimera Detection程序检测(http://rep8.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU)。获取的相似性较高的菌株序列采用Clustal W对序列进行遗传关系阵列比对后，使用MEGA4.0软件的邻近相连法(Neighbor-joining method)构建系统发育树。

本文所得到 16S rDNA序列已提交至GenBank核酸序列库，登录号为JQ838073-JQ838150。

脂酶、脲酶、淀粉酶、H₂O₂酶、蛋白酶，以及H₂S、有机酸的产生参照文献^[21]进行。此外，采用对峙培养法^[24]测定了78株放线菌对大肠埃希氏菌(Escherichia coli.，ATCC25922)、临床分离铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)及白色念珠菌(Candida albicans，ATCC66415)的拮抗性。上述4株病原菌中，前两株代表革兰氏阴性菌，后两株分别代表革兰氏阳性菌及真菌。若供试放线菌的琼脂块周围有抑菌圈产生，则表示该放线菌产生了抑制参试靶标菌生长的活性物质。

本研究从不同海拔位点的15种植物根际土中共得到88株放线菌，根据16S rDNA序列测定及菌体表型初步分析，选取78株代表性菌株进行研究。根据菌体表型及16S rDNA序列测定发现，Streptomyces spp.为主要类群，占分离菌株的93.6%，该属菌株在5个海拔位点的15种植物根际土中均有分布，且所占各海拔位点分离菌总数的比例≥80%；Nocardia spp.占分离菌株的5.1%，仅见于海拔2200 m的猪毛菜(QLS27和QLS44)、海拔2800 m的钉柱萎陵菜(QLS42)和3800 m处的甘肃蚤缀(QLS54)根际土中；1株潜在新属Micromonospora spp.的菌株分离自海拔2200 m处的沙生针茅(QLS96)根际土(图 1)。

图 1 不同海拔位点分离菌群丰度变化 Fig. 1 Relative abundance of three phylogenetic isolates at increasing altitudes

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结合16S rDNA序列、菌体形态及生理特征，所分离73株链霉菌可归为21个种，其分布特点如图 2所示：海拔3350 m处种类最多，为9种；3800 m处最少，为6种；2200、2800、4200 m居间，均为8种。链霉菌在不同植物根际土的分布为：4200 m甘肃黄芪根际土中分离种类最多，为6种；3800 m早熟禾根际土最少，仅1种。仅在海拔2200 m处的猪毛菜根际土中分离到的菌种有Streptomyces albolongus，沙生针茅根际土中的分离菌种有Streptomyces rectiviolaceus、Streptomyces bottropensis；2800 m处钉柱萎陵菜根际土中分离到的有Streptomyces bobili、Streptomyces specialis；3350 m处凤毛菊根际土分离到的有Streptomyces cyaneofuscatus、Streptomyces goshikiensis；3800 m处葶苈根际土中分离到的有Streptomyces candidus、Streptomyces aurantiacus；4200 m处小甘菊根际土中分离到的有Streptomyces sporoverrucosus、Streptomyces nojiriensis，甘肃黄芪根际土中的Streptomyces cyaneogriseus。此外，Streptomyces cavourensis在5个海拔位点均有分布(图 2)。

图 2 不同海拔位点链霉菌菌种分布 S.：Streptomyces链霉菌属；S. albolongus白长链霉菌；S. chryseus浅金链霉菌；S. microflavus细黄链霉菌；S. candidus纯白链霉菌；S. finlayi芬莱链霉菌；S. bobili包比利链霉菌；S. aureus金色链霉菌；S. anulatus环圈链霉菌；S. nojiriensis野尻链霉菌；S. cavourensis卡伍尔链霉菌；S. aurantiacus橘橙链霉菌；S. cyaneofuscatus蓝微褐链霉菌；S. rectiviolaceus直丝紫链霉菌；S. bottropensis波卓链霉菌；S. agglomeratus团孢链霉菌；S. cyaneogriseus蓝灰链霉菌；S. sporoverrucosus孢疣链霉菌；S. goshikiensis五色链霉菌；S. enissocaesilis淡紫褐链霉菌；另外，S. specialis和S. durmitorensis未查到对应中文名 Fig. 2 Distribution of Streptomyces strains at increasing altitudes

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图 3显示Streptomyces spp.、Nocardia spp.和1潜在新种三者之间的进化关系。链霉菌属菌株的属内进化关系如图 4所示，主要分为两大组(Group)。

图 3 祁连山老虎沟植物根际土放线菌系统进化树 系统发育树节间数字代表基于邻接法用再抽样分析所得bootstrap值，仅显示50%以上值，比例尺代表每个碱基位置改变值; S.：Streptomyces链霉菌属；N.：Nocardia诺卡氏菌属；M.: Micromonospora小单孢菌属 Fig. 3 Partial Neighbour-joining tree based on nearly complete 16S rDNA sequences showing relationships between selected isolates and the genera Streptomyces,Nocardia and Micromonospora

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图 4 祁连山老虎沟植物根际土链霉菌系统进化树(@表示筛选出的拮抗性菌株) 系统发育树节间数字代表基于邻接法用再抽样分析所得bootstrap值，仅显示50%以上值，比例尺代表每个碱基位置改变值; S.：Streptomyces链霉菌属 Fig. 4 Phylogenetic relationship of nearly complete 16S rRNA gene sequences of members of the genus Streptomyces isolated from plant rhizosphere soils in the Laohugou of the Qilian Mountain,rooted using the 16S rDNA sequence of Streptomyces ambofaciens

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组1：分离自钉柱委陵菜根际土的菌株QLS81与S.specialis聚为一支，相似性达99%。

组2：有52株分离菌与其在GenBank中同源性最高的菌株形成独立分支，其中42株菌聚为10个主要类群 (Cluster)。类群1，分离自甘肃黄芪根际土的6株菌和4株分别来自火绒草、驼绒黎、蛰状点地梅和金露梅根际土的菌株，与S.cavourensis聚为一支，相似性达100%；类群2包含4株分离菌，两株分离自甘肃黄芪根际土，菌株QLS04 和 QLS13分别分离自猪毛菜和金露梅根际土，与S.anulatus聚为一支，相似性达99.8%；类群3有5株分离菌，与S.microflavus聚为一支，相似性达99.6%，其中菌株QLS16、QLS17和QLS19分别分离自甘肃蚤缀、凤毛菊及早熟禾根际土，聚为一个亚支，菌株QLSQ03和QLSQ08分离自甘肃黄芪根际土，聚为另一个亚支；类群4的3株分离菌均分离自凤毛菊根际土，与S.cyaneofuscatus聚为一支，相似性达99%；类群5包含3株分离菌，均分离自四裂红景天根际土，与S.aureus聚为一支，相似性达100%；类群6包含2株分离菌，均分离自甘肃黄芪根际土，与S.enissocaesilis相似性达99%，聚为一支；类群7，3株分离菌QLS70、QLS35、QLS64分离自四裂红景天根际土，与S.chryseus聚为一支，相似性达99%；类群8，2株分离自甘肃黄芪根际土和另外2株分别分离自四裂红景天和驼绒黎根际土的菌株，与S.agglomeratus聚为一支，相似性达99%；类群9包含5株分离菌，其中4株分离自甘肃黄芪根际土，1株分离自钉柱萎陵菜，与S.durmitorensis聚为一个分支，相似性达100%；类群10包含3株分离菌，2株分离自驼绒黎，1株分离自沙生针茅，与S.aureus相似性达99%，聚为一支。

78株放线菌功能酶、有机酸和H₂S产生等结果显示(图 5)，H₂O₂酶、脂酶 2 (Tween-40)、脲酶、蛋白酶、脂酶 3 (Tween-80)、淀粉酶、H₂S、脂酶 1 (Tween-20)、可溶性色素及有机酸产生菌分别占供试菌株的89.7%、82.1%、70.5%、62.8%、53.8%、52.6%、48.7%、44.9%、32.1%和17.9%。其中，淀粉酶、脂酶 1、色素和有机酸仅由链霉菌产生。

图 5 各类次级代谢产物产生菌数量 Ts：Total strains供试菌株总数；Cat.：Catalase H2O2酶；Lip.2：Lipase 2脂酶 2；Ure.：Urease脲酶；Pro.：Protease蛋白酶；Lip.3：Lipase 3脂酶 3；Amy.：Amylase淀粉酶；Lip.1：Lipase 1脂酶 1；Pig.：Pigment色素；Oa：Organic acid有机酸 Fig. 5 The number of various secondary metabolites producing strains

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10类次级代谢物产生菌在5个海拔位点均有分布，但在不同海拔、不同植物根际土中呈差异性分布，具体分布信息如图 6、图 7所示。H₂O₂酶、脲酶产生菌在15种植物根际土均有分布，脂酶 2、H₂S、蛋白酶产生菌在其中14种植物根际土中分布，淀粉酶、脂酶 1产生菌则分布于12种植物根际土，色素、脂酶3产生菌在11种植物根际土中分布，而有机酸产生菌仅分布于9种植物根际土；此外，甘肃黄芪(2800 m和4200 m)、四裂红景天、凤毛菊、钉柱委陵菜和金露梅根际土中10类代谢物产生菌均有分布，但在甘肃黄芪和四裂红景天根际土中各类代谢物产生菌数量相对偏多。

图 6 10类代谢物产生菌在不同海拔位点的分布情况 Cat.：Catalase H2O2酶；Lip.2：Lipase 2脂酶 2；Ure.：Urease脲酶；Pro.：Protease蛋白酶；Lip.3：Lipase 3脂酶 3；Amy.：Amylase淀粉酶；H2S：H2S production硫化氢产生；Lip.1：Lipase 1脂酶 1；Pig.：Pigment色素；Oa：Organic acid有机酸 Fig. 6 Distribution of secondary metabolites producing strains at increasing altitudes

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图 7 10类代谢物产生菌在不同海拔位点植物根际土的分布情况 Al：Astragalus licentianu甘肃黄芪；Sg：Stipa glareosa沙生针茅；Sj：Saussurea japonica凤毛菊；Cl：Ceratoides latens驼绒黎；Ps：Potentilla saudersiana钉柱委陵菜；Pf：Potentilla fruticosa金露梅；Sc：Salsola collina猪毛菜；Rq：Rhodiola quadrifida四裂红景天；Ak：Arenaria kansuensis甘肃蚤缀；Ll：Leontopodium leontopodoides火绒草；Au：Androsace umbellate蛰状点地梅；Pa：Poa annua早熟禾；Cd：Cancrinia discoicea小甘菊；Dn：Draba nemorosa葶苈；Cat.：Catalase H2O2酶；Lip.2：Lipase 2脂酶 2；Ure.：Urease脲酶；Pro.：Protease蛋白酶；Lip.3：Lipase 3脂酶 3；Amy.：Amylase淀粉酶；H2S：H2S production硫化氢产生；Lip.1：Lipase 1脂酶 1；Pig.：Pigment色素；Oa.：Organic acid有机酸 Fig. 7 Distribution of secondary metabolites producing strains in rhizosphere soils of 15 plants on increasing altitudes

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研究发现，同一菌种的不同株之间，其生理功能也不尽相同，如菌株QLS06、QLS87、QLS18、QLS85、QLS02分离自不同海拔、不同植物根际土，与Streptomyces cavourensis相似性达100%，聚为同一分支，属同一菌种，但其次级代谢产物的类型和抗菌活性各不相同；与Streptomyces durmitorensis聚为同一分支的5株菌分离自同一海拔的不同植物根际土，其中4株(QLS45、QLS50、QLS76、QLS77)分离自甘肃黄芪根际土，1株(QLS33)分离自钉柱委陵菜根际土，其生理功能不尽相同，但黄芪根际土中的4株菌又具有一些相似的生理功能，如均产黄色素，都具有抗菌活性(表 2，图 4)。

78株放线菌拮抗性筛选结果表明，共有29株放线菌具有抗菌活性，其中2株菌能够抑制Escherichia coli生长、19株能抑制Staphylococcus aureus生长、1株菌能抑制Pseudomonas aeruginosa、14株能抑制Candida albicans生长；能同时抑制两种病原指示菌生长的放线菌有7株(表 3)。结合图 4分析表明，拮抗性菌株均来自链霉菌属，在组1及组2的10个类群中都有分布；并广泛分布于5个海拔位点的12种植物根际土中。其中，从药用植物甘肃黄芪和四裂红景天根际土中分离到的抗性菌株分别占拮抗性放线菌总数的40%、20%，共占60%。

链霉菌因代谢物丰富多样，具有很强的适应性而成为多种特殊生境的优势菌群^{[4, 5, 8, 25]}。Streptomyces spp.仍为优势分离菌群，Nocardia spp.仅见于3个不同海拔位点的3种植物根际土，1潜在新种分离自2200 m处沙生针茅根际土。73株链霉菌在不同海拔位点、不同植物根际土中的分布具有一定的差异性和特异性。造成菌群差异或特异性分布的因素，一方面可能是这些稀有放线菌(Nocardia spp.、Micromonospora spp.)对各自生存环境的高度依赖性，所占生态位相对狭窄，加之地上不同植物类型所提供的脱落物、分泌物不同，使这些微生物所必须的碳源和能源物质存在差异，导致菌群的差异或特异性分布^[26]；另一方面，严酷的高山环境对植物根际土链霉菌的分布具有选择作用。如研究发现，冰川细菌通过产生色素来对抗强烈的紫外辐射^[27]；高山环境长鞭红景天根际土中约35%的细菌有较强的产酸能力，这可能与其吸收难溶矿质元素如磷密不可分^[15]。本研究的10类代谢产物中，色素、有机酸、淀粉酶和脂酶1仅由链霉菌产生，拮抗性菌株也均来自链霉菌属，说明多样的次级代谢物对链霉菌适应高山环境有重要意义。此外，为适应高寒、缺氧、强紫外辐射等极端逆境，链霉菌会产生适应性变异，正如青藏高原冻土环境中的Streptomyces griseus，在不同冻土微环境中产不同代谢物，从而产生许多生理特异性菌株，广泛分布于冻土环境^[25]，本研究中Streptomyces cavourensis也因代谢产物丰富多样，广泛分布于5个不同海拔位点不同植物根际土中，对高山环境表现出很好的适应性。Zhang等^[27]也发现，普若岗日冰芯(海拔5970 m)不同深度的一些细菌虽然16S rDNA序列相近或完全相同，但其生理特性却表现出一定的异质性。这些研究结果提示，高寒极端生境中放线菌会产生特殊的代谢产物来适应生存环境，是新型化合物的重要来源。

近年来，国内外学者对一些极端生境如低温、盐碱、海洋环境中的放线菌进行了工业酶类或其它代谢物产生菌的筛选。杨宇容等^[28]对分离自云南白芒雪山(3500—5137 m)和中甸保护区(3400—3500 m)土壤的60株代表性链霉菌进行产酶特性检测，发现脲酶、淀粉酶和H₂S产生菌分别占供试菌株的81%、12%和11%；曹兰兰等^[29]从新疆哈密地区的盐湖中分离到63株放线菌，其中淀粉酶、蛋白酶和脂酶产生菌分别占供试菌株的73%、4.7%和22%；有学者在孟加拉湾海域^[4]分离到208株海洋放线菌，其中脂酶、蛋白酶、淀粉酶产生菌分别占供试菌株的78%、58%、33%；从青藏高原多年冻土中分离到54株链霉菌，其中大部分菌株代谢物丰富多样^[25]。本研究中，H₂O₂酶产生菌数量居首位，与青藏高原多年冻土环境分离株类似，这可能与低温、缺氧、干燥、强辐射等逆境胁迫下自由基的清除有关；相对于云南白茫雪山和中甸保护区肥沃的土壤环境，盐湖和高山灰钙土、冻土环境均寡营养，因此其内大部分放线菌产淀粉酶，以提高营养物质利用率；海洋环境中存在大量多聚物，其脂酶产生菌数量也相对偏高^[4]。本研究脂酶、脲酶、蛋白酶、H₂S产生菌数量均占分离菌的一半以上，可能与根际土多聚物或有机物的分解、养分循环利用有关^[5]。此外，各类代谢物产生菌在不同海拔、不同植物根际土中的分布也有所不同。研究表明^{[30, 31]}，绝大多数根际土放线菌能合成并分泌吲哚-3-乙酸，用以促进植物体的生长；另外，许多根系土微生物可大量分泌铁载体，用以结合环境中的Fe³⁺，在满足自身生长需求的同时也促进了植物体对铁离子的吸收^[32]。因而，植物根际土放线菌代谢产物的种类、产量与其所依赖的植物体密不可分。本研究中，与Streptomyces durmitorensis相似性达99%的菌株有5株，分布于同一海拔位点，其生理特性各不相同，但黄芪根际土中的4株菌又表现出相似的生理特征，如都产黄色素、都有抗菌活性，而分离自钉柱委陵菜根际土的QLS33则无此特性。Germida等^[33]的研究结果也表明植物对其根际土微生物的作用大于土壤本身对其微生物的影响。由此可见，高山植物根际土放线菌处于低温、缺氧、强辐射等极端逆境下，营养来源主要是一些根际凋落物或分泌物等^[5]，独特的生存条件及营养利用方式决定了其代谢产物的特异性和多样性。

本研究用于拮抗性筛选的4株靶标菌均为临床致病菌，抗性结果表明，有29株放线菌对病原微生物表现出了抗菌活性，占供试菌株的37.2%。其中，从药用植物甘肃黄芪和四裂红景天根际土中分离到的抗性菌株占拮抗性放线菌总数的60%。10类次级代谢物产生菌在这两种药用植物根系土中的数量也最多。研究发现^{[14, 34]}，根际土放线菌可利用一些植物的根际分泌物合成抗菌活性物质，抑制一些病原菌的生长。如Ouhdouch等^[35]从药用植物根际土中分离到10株对Candida albicans和Candida tropicalis有抗性的放线菌株；Thangapandian等^[36]从药用植物根际土中得到8株对真菌有抗性的链霉菌。这些结果进一步说明，药用植物根系可能会分泌一些特殊的有机物或无机物，参与相关放线菌活性物质的合成。除受植物根际影响外，高山植物根际土放线菌与海洋^[4]、冻土^[25]、盐碱^[29]等极端环境放线菌一样，处于极端恶劣的自然条件下，营养物质资源匮乏，它们通过合成一些抗性物质来抑制细菌、真菌甚至一些放线菌，从而在竞争中取得优势。因此，植物体的选择作用和土壤微环境的压力使高山植物根系土放线菌具有产新型生物活性化合物的潜力。

综上所述，祁连山老虎沟地区不同海拔植物根际土放线菌资源丰富，代谢产物多样，与不同植物种类以及海拔高度决定的生态环境密切相关；放线菌对临床致病菌具有拮抗作用。该结果将为开展以高山地区为代表的极端环境植物根际土放线菌多样性及其资源高效利用研究提供借鉴。

致谢：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所陈拓研究员、秦翔研究员及祁连山冰川生态观测站在采样及野外调查工作中给予支持，李祥锴教授、Duncan E. Jackson博士帮助修改文章，特此致谢。