生态学报  2014, Vol. 34 Issue (11): 2900-2906

文章信息

金忠民, 沙伟, 刘丽杰, 潘林, 莫继先, 郝宇
JIN Zhongmin, SHA Wei, LIU Lijie, PAN Lin, MO Jixian, HAO Yu
铅镉抗性菌株JB11强化植物对污染土壤中铅镉的吸收
Lead- and cadmium-resistant bacterial strain JB11 enhances lead and cadmium uptake in the phytoremediation of soils
生态学报, 2014, 34(11): 2900-2906
Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(11): 2900-2906
http://dx.doi.org/10.5846/stxb201302200282

文章历史

收稿日期:2013-2-20
网络出版日期:2014-3-7
铅镉抗性菌株JB11强化植物对污染土壤中铅镉的吸收
金忠民 , 沙伟, 刘丽杰, 潘林, 莫继先, 郝宇    
齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 齐齐哈尔 161006
摘要:研究了铅、镉抗性菌株 (JB11)和生物降解螯合剂乙二胺二琥珀酸(S,S)-EDDS)提高高羊茅和红三叶草吸收土壤中铅、镉的能力。从土壤样品中筛选出1株对Cd、Pb具有较强抗性的菌株JB11,经鉴定为成团泛菌属(Pantoea agglomerans)。JB11对Pb2+ 、Cd2+、Cr6+ 、Cu2+ 、Zn2+、Ni2+等多种重金属和卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、四环素等抗生素具有抗性, 在温度 15-35℃和 pH 为 5.0-9.0范围内生长良好,最适生长温度为30℃,最适 pH值为7.0左右,在低于 3%的 NaCl浓度下生长良好。盆栽试验研究了菌株JB11、EDDS及1/2EDDS+JB11 3种处理下对生长在Cd 100 mg/kg 、Cd 200 mg/kg 、Pb 500 mg/kg 和 Pb 1000 mg/kg的土壤中的高羊茅和红三叶生长及从土壤富集Cd、Pb能力的影响。结果表明,外加JB11能使高羊茅和红三叶的干重分别比对照都有增加。除外加JB11后在经Pb 1000 mg/kg处理的土壤中高羊茅地上部的Pb浓度、经Cd 200 mg/kg处理的土壤中红三叶地上部的Cd浓度以及经Cd 100 mg/kg处理的土壤中高羊茅和红三叶根部的Cd浓度以外,外加JB11后对其他重金属处理植物中Pb和Cd的含量都显著增加。外加EDDS后除在经Pb 500 mg/kg的土壤中高羊茅根部的Pb浓度增加差异不显著,对其余重金属处理都可产生显著的影响 (P < 0.05)。1/2EDDS+JB11的复合处理下植物重金属吸收量多数高于JB11和EDDS单独处理,JB11用于植物修复土壤Pb和Cd污染具有很大的潜力。
关键词铅镉抗性菌株    植物修复    乙二胺二琥珀酸(EDDS)    
Lead- and cadmium-resistant bacterial strain JB11 enhances lead and cadmium uptake in the phytoremediation of soils
JIN Zhongmin , SHA Wei, LIU Lijie, PAN Lin, MO Jixian, HAO Yu    
College of Agriculture, Forestry and Life Science, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China
Abstract:We investigated the abilities of a Pb- and Cd-resistant bacterial strain (JB11) and the biodegradable chelator ethylenediamine dissociate ([S,S]-EDDS) to improve the absorption of Pb and Cd from soil by tall fescue and red clover. JB11 was isolated from contaminated soil samples and analyzed for Pb- and Cd-resistance. JB11 was identified as Pantoea agglomerans. Studies of the biological characteristics of JB11 showed that it is generally resistant to heavy metals, including Cd2+, Cr6+, Cu2+, Ni2+, Pb2+, and Zn2+ and that it is also resistant to antibiotics, such as ampicillin, kanamycin, streptomycin, and tetracycline. Strain JB11 grows well at temperatures between 15 and 35℃, pH values of 5.0-9.0, and NaCl concentrations below 3%. The optimum temperature for JB11 is 30℃ and the ideal pH value is approximately 7.0. Tall fescue and red clover were grown in pots with soil containing Cd at 100 mg/kg, Cd at 200 mg/kg, Pb at 500 mg/kg, or Pb at 1000 mg/kg, to which were added JB11, EDDS, a combination of JB11 and EDDS, or water. Pot experiments were performed to study the effects of JB11 and EDDS on the abilities of tall fescue and red clover to take up Cd and Pb from the soil and on their growth. The amounts of biomass produced by tall fescue and red clover were significantly higher in the JB11 treatments than in the untreated control plants. The Pb and Cd concentrations were significantly higher (P<0.05) in the JB11-treated plants than in the control plants, with the exception of the Pb concentration in the above-ground parts of tall fescue growing in soil containing Pb at 1000 mg/kg, the Cd concentration in the above-ground parts of red clover growing in soil containing Cd at 200 mg/kg, and the Cd concentrations in tall fescue and red clover roots in soil containing Cd at 100 mg/kg. The Pb and Cd concentrations were significantly higher (P < 0.05) in the EDDS-treated plants than in the control plants, with the exception of the Pb concentrations in the tall fescue roots in soils containing Pb at 500 mg/kg. The Pb and Cd concentrations in the tall fescue and red clover increased in response to the combined EDDS and JB11 treatment. The amounts of Pb and Cd absorbed by the plants were higher in most of the combined (1:1) EDDS- and JB11-treated plants than in the plants treated with only EDDS or only JB11. JB11 is Pb- and Cd-resistant, and its application to the soil improved the net uptake of Pb and Cd from the soil by the experimental plants. There is, therefore, great potential for viable phytoremediation using JB11.
Key words: lead- and cadmium-resistant bacterial strain    phytoremediation    [S,S]-EDDS(EDDS)    

随着人口的快速增长、工业的迅速发展、农药与化肥的大量施用,大量的重金属污染物进入土壤环境,致使世界各国土壤出现不同程度的重金属污染[1]。重金属污染不仅导致土壤退化、农作物产量和品质降低,影响大气和水环境质量,而且可能通过直接接触、食物链传递等途径危及人类的健康和生命。据统计,我国受Cd、As、Pb等重金属污染的耕地面积近2000万hm2,约占总耕地面积的1/5[2]。Cd是对人、动植物毒性大的一种重金属元素,也是一种常见的重金属污染元素[3],Cd可在人体内长期积累,对肾、肺、肝、脑、骨骼和血液产生一系列损伤。我国Cd污染农田面积已达1.33万hm2,污灌区生产的大米中Cd含量严重超标,每年因重金属污染导致的粮食减产超过1000万t,被重金属污染的粮食多达1200万t,合计经济损失至少200亿元[4]。Pb是一种积累性毒物,逐渐严重的慢性中毒,能够引发视力障碍、耳鸣、头疼等情况。

在我国耕地资源日益紧张的今天,安全有效地修复重金属污染土壤已成为紧迫任务,有关生物修复技术的研究引起众多研究者的关注[4]。生物修复技术主要包括植物修复和微生物修复技术。重金属污染土壤的植物修复技术是一种新兴的绿色生物技术,已经成为了土壤污染整治的重要手段之一,亦是目前仅见的一种土壤污染治理的环境友好技术[5]。植物修复会受到植物生长速度和生物量的限制,还会受到污染物浓度、土壤类型、温度、湿度、营养等环境条件制约[5],限制了它的大规模应用。土壤污染的微生物修复是利用对有毒重金属离子有抗性的微生物来改变和转化金属离子形态。它的局限性是微生物去除不彻底,修复效果受环境影响较大,可能与土著菌株竞争或难以适应环境,和植物修复一样修复周期也相对较长[6]

红三叶(Trifolium pratense)为豆科多年生草本,对Zn有较强的耐性和一定的富集能力,Li等[7]研究红三叶可在Zn浓度为1000 mg/kg的土壤上正常生长,地上部和根部可富集Zn1266和629 mg/kg。高羊茅(Festuca arundinacea)为禾本科多年生草本,由于其快速生长且可耐高浓度的Zn、Pb可用于修复Zn、Pb污染土壤。Begonia等[8]研究高羊茅在土壤Pb浓度为1000 mg/kg并添加醋酸和EDTA时,生长未受抑制,地上部和根部Pb浓度分别达到4500和1500 mg/kg。

[S,S]-EDDS (简称EDDS),乙二胺二琥珀酸,是一种低毒且易生物降解的螯合剂[9],螯合能力较强,能够与过渡金属及放射性核素形成稳固的螯合体[10],对土壤中的微生物和真菌的影响都比较小。在各种环境介质中完全降解只需5—8 d[11]

本研究从采自齐齐哈尔嫩江葫芦头排污口的土壤中筛选出对重金属Cd、Pb具有较强抗性的菌株,研究其活化效能、环境影响因素等,并通过盆栽试验研究菌株、EDDS 和EDDS/菌株对高羊茅和红三叶从污染土壤中吸收、积累铅镉的影响,比较3种处理促进植物富集铅镉的能力,以寻找更加高效经济的修复措施,以期对重金属污染土壤的可持续治理提供科学借鉴。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 培养基

为低磷有氮培养基: 蔗糖10 g,(NH4)2SO4 1 g,K2HPO4 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.1 g,酵母粉 0.5 g,CaCO3 0.5 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL,pH=7.0,121 ℃下湿热灭菌 30 min。将 Pb(NO3)2、3CdSO4·8H2O 配成10 g/L 的溶液,单独灭菌,然后与低磷有氮培养基混合倒平板。

1.1.2 供试土壤和植物

筛选抗性菌株土壤取自齐齐哈尔嫩江葫芦头重金属污染区,土壤风干后过100目筛,测定理化性质,pH值5.87±0.29,有机质含量(15.11±0.72) g/kg,全氮含量(0.31±0.01) g/kg,全磷含量(1.73±0.08) g/kg,全钾含量(8.09±0.39) g/kg,速效钾含量(179.2±8.91) g/kg,电导率EC 1.95±0.09,全铅含量(37.7±1.53)mg/kg,全镉含量(0.28±0.02)mg/kg。

种植植物土壤取自齐齐哈尔大学农园,测定理化性质,pH值6.91±0.41,有机质含量(16.12±0.9) g/kg,全氮含量(0.54±0.02) g/kg,全磷含量(1.83±0.32) g/kg,全钾含量(8.81±0.51) g/kg,速效钾含量(19.8±0.78) g/kg,电导率EC 2.05±0.21,全铅含量(11.7±1.05)mg/kg,全镉含量(0.06±0.01) mg/kg。

高羊茅和红三叶种子购自北京种子公司。

1.2 菌株筛选及培养

取土样5 g至装有45 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中,放置于28 ℃摇床内振荡30 min。然后取样做梯度稀释,稀释浓度为10-3、10-4、10-5,分别吸取不同浓度土壤溶液100 μL涂布于含50 mg/L Cd2+和200 mg/L Pb2+的低磷有氮固体培养基平板上,置于30 ℃培养箱中培养48 h后,在平板上挑取分离较好、生长丰满的细菌单菌落,转入逐步提高 Pb2+和 Cd2+浓度的培养基上,从中筛选出Cd2+和Pb2+的抗性菌株。选取在含Pb2+浓度为1200 mg/L和Cd2+浓度为300 mg/L的平板上生长较快、较好的菌株进行纯化培养。

1.3 抗性菌株16S rDNA的PCR扩增和序列测定

液体培养16 h,以1%的接种量接入培养基中,同时设接入1%去离子水的液体培养基作为对照。30 ℃下摇床培养 48 h后,培养液在 10000 r/min条件下离心10 min,用电感耦合等离子体质谱法(ICP-)测定重金属浓度。选出一株对不溶性重金属溶解能力最强的菌株作为以下试验的材料。对菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化试验、16S rDNA序列同源性比对分析,以确定其分类地位。菌株形态及生理生化特性测定参照东秀珠等[12]的方法。提取菌株的总DNA,利用细菌 16S rDNA 通用引物F(5′-3′):AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG;R(5′—3′):TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T进行PCR扩增。PCR反应体系为50 L,所用程序为:预变性:94 ℃,10 min; 变性:94 ℃,l min;退火:51 ℃,1 min;延伸:72 ℃,1 min,共30个循环,最后 72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物由哈尔滨奥拓生物技术有限公司测序,测序结果在 GenBank中与相关序列进行同源性比对。NCBI网站上用Blast进行核苷酸同源性比较,初步鉴定其种属。

1.4 菌株的生物学特性

菌株对重金属和抗生素的抗性试验,将菌株划线接种于含不同浓度重金属 (Pb2+ 、Cd2+、Cr6+ 、Cu2+ 、Zn2+、Ni2+)和不同浓度抗生素 (卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、四环素)的培养基上,30 ℃下培养 48 h,转接 2 次,观察其能否生长及生长情况。环境条件对菌株JB11的影响,将供试菌株30 ℃活化16 h,以5%的接种量接入有氮培养液中,温度分别设置为20、30和40 ℃,pH值分别设置为3、5、6、7、8、9和10,NaCl浓度为1.0%、2.0%、3.0%和4.0%,培养18 h,使用 751 分光光度计测定各菌悬液的OD600nm 值。

1.5 菌株对高羊茅和红三叶富集铅镉的影响

种子在播种前浸种12 h,经 2% 次氯酸钠表面消毒后播种。在500 mL 塑料花盆中分别装入含Cd 100mg/kg 、Cd 200 mg/kg 、Pb 500 mg/kg 和 Pb 1000 mg/kg的土样400 g,每盆分别播入高羊茅和红三叶种子1—1.5 g,播种30 d,待植株在重金属污染土壤中生长良好后,在植物根部接入培养至对数生长期的供试菌株,设以下4种处理:接无菌水的空白对照 (CK) 、接无菌水洗的 1×106cfu/g菌液 (JB11) 、加 1.0 mmol/kg EDDS 、0.5 mmol/kg EDDS + 5×105cfu/g 菌液 (1/2 EDDS+JB11)各20 mL。 播种45d后收获,沿土面剪取植株地上部,洗出根系,105 ℃下杀青烘干2 h,称地上部和根部的干重。植物经3HNO3∶2H2O2消解后用ICP-测定测重金属离子浓度。分别采集不同处理的根际土,平板计数法分析土壤中抗性细菌和总细菌的数量。

1.6 数据分析

所有试验均设 3个重复,所获数据利用 Excel和 SPSS 13.0软件进行统计分析及差异显著性检验。

2 结果与分析 2.1 菌株筛选与鉴定

对溶液中不溶性Pb、Cd的活化实验结果表明,菌株JB11在含 Pb浓度为400 mg/L和含Cd 浓度为100 mg/L的培养基中良好生长,而且能活化沉淀态Pb、Cd,使溶液中Pb2+、Cd2+浓度增加,使培养液中的 Pb2+ 浓度达到 171.4 mg/L,Cd2+浓度达到46.9 mg/L,显著高于不接菌对照 (Pb2+2.08 mg/L和 Cd2+1.45 mg/L) (P<0.05)。菌株 JB11在有氮培养基中呈白色或淡黄色半透明圆形菌落,湿润,菌体杆状,革兰氏染色阴性,甲基红反应阴性,V-P反应阳性,能氧化葡萄糖产酸,柠檬酸反应阳性,不水解淀粉,明胶液化呈阴性,吲哚反应阴性;利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增,得到长度约为1500kb的扩增产物,序列与Pantoea agglomerans有较高的同源性 (99%)。结合形态学、生理生化特性,初步鉴定菌株JB11为成团泛菌(Pantoea agglomerans.),Genbank登录号为JX262490。

2.2 菌株JB11的生物学特性

菌株JB11对重金属和抗生素的抗性较普遍,能在含 Pb2+1500 mg/L 、Cd2+200 mg/L 、Cu2+10 mg/L 、Ni2+20 mg/L 、Zn2+300 mg/L 的低磷有氮培养基中良好生长,对 Cr6+不具抗性。菌株JB11在含卡那霉素30 mg/L、氨苄青霉素200 mg/L、四环素20 mg/L、链霉素10 mg/L的有氮培养基中良好生长。

菌株JB11在温度 12—38 ℃和 pH值 为 5.0—9.0范围内生长良好,最适生长温度为30 ℃,最适 pH值为7.0左右,在低于 3%的 NaCl浓度下生长良好。

2.3 菌株JB11、EDDS 及两者复合处理对高羊茅和红三叶富集土壤中铅镉的影响 2.3.1 不同处理对高羊茅和红三叶生物量的影响

图 1图 2可知,接菌JB11的盆栽中高羊茅和红三叶生物量均高于其它处理。含 Cd 100 mg/kg 、Cd 200 mg/kg 、Pb 500 mg/kg 和 Pb 1000 mg/kg 的土壤中接菌JB11后高羊茅地上部干重分别比对照高49.8%、35%、37.3%和31.3%,根重分别比对照增加41.7%、18.6%、11.0%和14.5%;红三叶地上部干重分别比对照高42.2%、27.5%、26.6%和16.8%,根重分别比对照增加18.1%、26.2%、19.4%和53.2%(差异显著,P<0.05),可见,菌株JB11对高羊茅和红三叶的生长有较明显促进作用,可以缓解重金属对植物的毒害作用。 EDDS处理使Cd、Pb污染土壤中供试植物的生物量也有不同程度的增加,但差异不显著(P<0.05)。EDDS能够使土壤中重金属的溶解度增加,促进重金属从根部向地上部运转,当部分金属离子穿过细胞壁和细胞膜进入植物细胞后,能和细胞质中的蛋白质等形成复杂的稳定螯合物,它们能使重金属的毒性降低[13],从而增加植物生物量。1/2 EDDS +JB11处理的植物干重介于接JB11和接 EDDS的处理之间。

图 1 不同处理对生长在不同浓度Pb、Cd中的高羊茅和红三叶地上部干重的影响 Fig. 1 Effect of different treatment on shoot (above-ground) dry weight of tall fescue and red clover grown in different concentrations of Cd and Pb
图 2 不同处理对生长在不同浓度Pb、Cd中的高羊茅和红三叶根部干重的影响 Fig. 2 Effect of different treatment on root dry weight of tall fescue and red clover grown in different concentrations of Cd and Pb
2.3.2 不同处理对高羊茅和红三叶富集铅镉的影响

表 1可知,外加JB11后高羊茅和红三叶在各种污染土壤中地上部和根部积累的Pb和Cd含量都增加,JB11可以促进高羊茅和红三叶对Pb和Cd的积累,增幅较大的是在经Cd 100 mg/kg处理的土壤中高羊茅和红三叶地上部Cd的含量分别增加130.4%和164.3%,在经Cd 200 mg/kg处理的土壤中高羊茅地上部和红三叶根部Cd的含量分别增加148.0%和64.1%(P<0.05),土壤中有效Cd的含量分别比对照增加9.5%和18.8%。在经Pb 1000 mg/kg处理的土壤中高羊茅地上部的Pb浓度、经Cd 200 mg/kg处理的土壤中高羊茅根部和红三叶地上部的Cd浓度增加不显著(P<0.05),可能与重金属浓度较高有关,高浓度Pb和Cd处理使JB11的促高羊茅和红三叶富集重金属的能力有所降低,土壤中有效重金属含量和对照比增加幅度较小,与菌株活化能力降低有关。植物富集重金属能力降低也可能是高浓度金属离子对根的伤害增大,影响根的活力和吸附能力。外加EDDS后在经Pb 500 mg/kg和Cd 200 mg/kg处理的土壤中高羊茅根部的Pb浓度增加差异不显著,其余处理差异显著 (P<0.05)。加 EDDS能使高羊茅和红三叶地上部Pb、Cd含量大幅度增加,可能是EDDS促进土壤固相中重金属的释放,促进Pb、Cd由植物根部向地上部的转运[9],但 EDDS对植物根部Pb、Cd含量的影响不一,多数处理都高于对照(P<0.05)。多数外加1/2EDDS+JB11的土壤植物体内Pb、Cd含量介于加JB11和EDDS的处理之间,有的处理效果优于单独加JB11和EDDS的效果,这可能是因为细菌分泌物使土壤酸化,与EDDS结合可以提高对重金属的吸收效率[14]。综合1 /2EDDS+JB11处理的富集效果更好,更经济。高羊茅和红三叶地上部和根部含Pb、Cd量随着土壤含Pb、Cd浓度提高而增加,根部的含量远大于地上部。这可能是因为植物根通过离子交换、质流运移和根毛表面接触等多种方式从土壤溶液中摄取重金属,但根系内胚层对重金属元素的通透性较低,当它们从根部向中柱迁移时就会受到内皮层凯氏带的阻拦,导致植物吸收的重金属主要累积在根部[15]。两种重金属在高羊茅和红三叶体内的主要以根积累为主,可以在重金属污染土壤中种植高羊茅和红三叶,使受污染土壤不继续被侵蚀,并减少土壤渗漏而防止重金属污染的迁移,又可使其在根部积累和沉淀[16]

表1 不同处理对高羊茅和红三叶植株内Pb、Cd含量的影响 Table 1 Effect of different treatment on the concentrations of Cd and Pb in tall fescue and red clover
土壤重金属含量 Heavy Metal concentrations in soils/(mg/kg) 处理 Treatment高羊茅 Tall fescue/(mg/kg) 红三叶 Red clover/(mg/kg)
地上部Shoot 根Root地上部Shoot 根Root
同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
Pb500对照CK29.6c117.4b 26.4c111.1c
菌株JB1142.3b155.1a43.4b149.3b
乙二胺二琥珀酸 EDDS39.1b122.2b69.1a159.1b
1/2EDDS+JB1158.1a158.9a71.3a183.6a
Pb1000CK100.1b269.9c91.3c229.5c
JB11121.8b300.3b112.6b287.7b
EDDS147.4a318.1b193.8a298.5b
1/2EDDS+JB11161.5a379.1a186.3a312.1a
Cd 100CK16.1c189.5b11.2c39.2b
JB1137.1b201.6b29.6b43.6b
EDDS78.9a300.6a68.4a53.5a
1/2EDDS+JB1142.3b291.7a62.2b55.3a
Cd 200CK35.2c330.0a17.1b66.6b
JB1187.3b348.2a23.5b109.3a
EDDS126.8a312.1a45.4a99.9a
1/2EDDS+JB1193.6b338.7a47.3a101.1a
3 结论与讨论

微生物-植物修复联合修复充分发挥植物与微生物修复的各自优势,利用植物和微生物的共存体系提高植物修复效率;螯合剂-植物修复耗费低,具有进行大范围修复污染土壤的潜能;植物修复重金属污染物的过程分两个阶段:一是植物根系吸收重金属并运输到地上部,二是超富集植物对重金属离子的螯合和贮存。Bradley等研究发现接种过菌根的植物对吸收富集重金属污染物的能力增加,重金属抗性菌株不同,对植物富集重金属及生长发育的影响也不同,植物根际重金属被某些抗性菌株活化后,会显著提高植物吸收重金属的能力,对植物生长有明显促进作用,促使重金属向植株地上部转移[17]。向土壤中添加移动剂来增加土壤中活化态重金属浓度,进而促进植物对金属的吸收和富集[18]。EDDS能激活土壤中重金属离子,由不溶态转化为可溶态,促进植物的吸收,Cao 等[19]采用了螯合剂 EDDS和MGDA,来促进植物紫茉莉对Pb和Zn吸收。

本试验研究了高羊茅和红三叶对Cd、Pb的富集特征,利用Pb、Cd抗性菌株JB11与螯合剂EDDS对Cd、Pb污染土壤进行组合修复,本条件下研究结果表明,菌株JB11能使高羊茅和红三叶生物量显著增加,也使植株内的Pb、Cd总含量均显著增加 (P<0.05)。菌株JB11 对高羊茅的Cd、Pb积累的增加量大于对红三叶。同时表明本研究采用的高羊茅和红三叶对Pb、Cd的富集量有限,可能是由培养条件和植物种类决定的,为了大幅度提高微生物强化植物修复的效率,应加强Pb、Cd超积累植物与菌株的相互作用方面的研究。并且使用半量EDDS和菌液处理后,高羊茅和红三叶Pb、Cd积累量多数高于JB11和EDDS单独处理。

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