文章信息
- 王虎, 吴玲玲, 周立辉, 胡妍妍, 马小魁
- WANG Hu, WU Lingling, ZHOU Lihui, HU Yanyan, MA Xiaokui
- 陕北地区石油污染土壤中不动杆菌属的筛选、鉴定及降解性能
- Identification and oil-degrading performance of Acinetobacter sp. isolated from North Shaanxi oil-contaminated soil
- 生态学报, 2014, 34(11): 2907-2915
- Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(11): 2907-2915
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201302060248
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文章历史
- 收稿日期:2013-2-6
- 网络出版日期:2014-3-7
2. 中国石油长庆油田油气工艺研究院, 西安 710018
2. Oil Gas Technology Research Institute Changqing Oilfield Company, Xi'an 710018, China
随着我国石化工业的快速发展和石油产品在各行业中的广泛应用,土壤中的石油污染日趋严重[1],人类面临的土壤石油污染的修复治理任务日益紧迫。与物理化学修复方法相比,采用生物修复技术处理石油污染土壤具有不造成二次污染,处理费用低,可彻底降解污染物等优点[2, 3, 4, 5, 6, 7]。迄今为止,已经发现能够降解原油的微生物多达100多个属,主要包括有不动杆菌属(Acinetobacter)[8]、假单胞菌属(Pseudomonas)[9, 10]、红球菌属(Rhodococcus)[10]、芽孢杆菌属(Bacillus)[11, 12]、链霉菌属(Streptomyces)[13]、产碱菌属(Alcaligenes sp.)[14]等,其中对不动杆菌属菌株的降解性能研究备受关注,但是,其所处环境因素和外加营养物质对此类菌降解效果的影响及其机制研究很少,而此对现场生物修复技术的建立和实施有很大限制。
本研究从陕北地区石油污染土壤中筛选并鉴定得到两株不动杆菌属的高效石油降解菌,并对影响这些菌株降解石油的营养和环境条件进行了研究和优化,以期为实际石油污染土壤的生物修复提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 原油及土样来源实验所用原油:取自陕北产油区原油(陕西长庆油田分公司提供)。石油污染土壤采自陕北地区油田油井废弃钻井液储蓄池附近,用无菌采集袋收集于4 ℃冰箱中保存待用。
1.2 培养基组成牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基组成参照一般培养基手册。
石油富集液体培养基:石油4 g/L,K2HPO4 2 g/L,KH2PO4 0.2 g/L,NaCl 0.04,(NH4)2SO4 5 g/L,NaNO3 5 g/L,MgSO4 0.4 g/L,CaCl2 0.2 g/L,微量元素浓缩液5 mL,1 L水,pH值 7。 其中微量元素浓缩液:FeSO4 4 g/L,MnSO4 4 g/L,ZnSO4 4 g/L,CuSO4 4 g/L,H3BO3 4 g/L。石油富集固体培养基:在石油富集液体培养基中外加2%的琼脂。
石油降解液体培养基:K2HPO4 0.5 g/L,KH2PO4 0.5 g/L,MgSO4 0.4 g/L,NH4NO3 1 g/L,NaCl 1 g/L,CaCl2 0.02 g/L,微量元素浓缩液5 mL,石油4,1 L水,pH值 7。其中微量元素浓缩液组成同上。
1.3 石油降解菌的分离与鉴定 1.3.1 石油降解菌的分离称取石油污染土壤1 g加入到已灭菌的石油富集液体培养基中,在160 r/min、28 ℃条件下培养7d。按5%的接种量转接到新的石油富集液体培养基中,在同样条件下连续转接培养4次后,取1 mL富集液按不同的稀释度依次稀释至10-5、10-6、10-7 ,各取100 μL涂布于石油富集固体培养基上。在恒温培养箱中培养后,观察菌落形态、大小、颜色,挑取其中的单菌落镜检确认其细胞形态是否单一,并划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进一步进行纯化培养,直到获得单一细胞形态。
1.3.2 石油降解菌的鉴定(1) 菌落形态鉴定
通过全自动菌落分析仪对菌落形态进行观察。
(2) 菌株分子鉴定
用细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取石油降解菌的总DNA。分离菌株的分子鉴定扩增反应体系采用16S rDNA通用引物,16S rDNA的专一性正向引物7 f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和反向引物1540 r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增,PCR试验反应体系为 50 μL,其中模板DNA 5 μL,PCR Mix 25 μL,引物7 f1 μL,引物1540 r1 μL,去离子水(ddH2O) 18 μL。反应程序如下:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,72 ℃补充延伸10 min,共进行35个循环,4 ℃保存,1%琼脂糖凝胶电泳检测。送上海生工生物工程股份有限公司测序,测序结果通过NCBI数据库比对分析,从中选取同源性较高的序列,利用MEGA 4.0软件,采用邻接法构建系统进化树。
1.4 原油降解实验 1.4.1 种子液制备用接种环从牛肉膏蛋白胨固体培养基上,挑取单菌落接种于新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基中,在160 r/min、28 ℃条件下扩大培养24h,做为种子培养液。
1.4.2 原油降解率测定采用重量法测定原油降解率[15]。
1.4.3 原油降解过程中微生物生长量测定通过可见光-紫外分光光度计(THERMOE)在波长600 nm处测定微定生物生长量。
1.4.4 影响石油降解菌降解效果的因素研究微生物对石油的降解效果受到多种因素的影响,如温度、盐浓度、pH值、不同形态的N源与P源、接种量等[16],主要探讨盐浓度、pH值、不同形态的N源与P源、接种量等因素对两株石油降解菌处理石油的影响,以期探讨两株菌的最佳降解条件。
将种子液接种到50 mL原油降解液体培养基中,分别考察不同氮源、盐浓度、pH值、磷源、接种量等因素对其降解效果的影响。氮源影响试验组设硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素、蛋白胨等5个试验组,盐浓度影响试验设NaCl浓度 1%、2%、3%、4%、5%等5个梯度试验组,pH值影响试验设5.0、6.0、7.0、8.0、9.0等5个梯度试验组,磷源影响试验组设K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、K2HPO4+KH2PO4 (质量比为1∶1)等4个试验组,接种量影响试验设2%、4%、6%、8%、10%等5个梯度试验组。在160 r/min、28 ℃条件下培养7 d。取样并测定石油降解率,以不接菌的培养基作为空白对照,每个因素做3个平行试验。
1.4.5 降解前后原油的石油烃类变化分析采用气质联用仪(日本岛津Thermo DSQⅡ)对石油降解前后的组分变化进行分析。
GC-MS条件:采用 Thermo DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪,HP-5 MS 石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。进样口温度220 ℃,传输线温度260 ℃,离子源260 ℃;气体为高纯氦气;进样量1 μL,不分流进样;扫描质量范围:50—550 m/z;柱温在70 ℃保留4 min,再以10 ℃/min的速率升到150 ℃,保留2 min,最后以6 ℃/min的速度升至260 ℃,保持15 min。
2 结果与分析 2.1 石油降解菌的菌株鉴定 2.1.1 两株菌的菌落形态观察通过全自动菌落分析仪对两株菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的形态进行观察 A.sp 1菌落形态大且呈圆形,白色,表面突起,湿润有光泽,边缘整齐,显微观察呈杆状。A.sp 2较A.sp 1菌落形态小,显微观察呈短杆状。革兰氏染色均为阴性、无芽孢。通过对两株菌的部分生理生化研究,结果显示,两株菌除糖发酵和柠檬酸盐试验是阳性反应外,淀粉水解试验、明胶液化试验、吲哚试验、甲基红和V.P试验均显示为阴性反应。
2.1.2 分子鉴定提取菌株的总DNA,经16S rDNA特异引物进行PCR扩增后,通过琼脂糖凝胶电泳进行验证,获得两条单一约1.5 kb产物,并送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将测序结果在NCBI数据库中进行比对,使用MEGA 4.0 软件根据基因同源性序列构建系统发育树,通过自举分析进行置信度检测,自举数为1000(图 2)。
结合形态和部分生理生化反应及分子生物学鉴定结果确定,两株石油降解菌均属于不动杆菌(Acinetobacter sp.),分别命名为A.sp 1、A.sp 2。
2.2 不同的氮源对两株菌降解石油效果的影响菌株A.sp 1、A.sp 2在不同氮源条件下均生长良好,其中A.sp 1以尿素为氮源时,降解体系中的生物量和石油降解率均达到最高,而A.sp 2以硝酸铵为氮源时,降解体系中的生物量和石油降解率达到最高。如图 2所示:不同菌株对不同的氮源有不同的代谢水平,从而在一定程度上影响了不同菌株的石油利用效率。本试验选择尿素作为A.sp 1菌株的最适氮源,硝酸铵作为A.sp 2菌株的最适氮源。
2.3 不同的盐浓度对两株菌降解石油效果的影响两株菌在盐浓度1%—5%均生长良好,且在盐浓度为1%时,两株菌对石油的降解率达到最高,虽然两株菌都随着盐度的递增石油降解率在不断的降低,但都长势良好,表现出了一定的盐度耐受能力。实验结果如图 2所示,与贾群超[17]等报道的结果一致,即微生物细胞对石油烃的生物降解率随盐浓度的增大而减小。
2.4 pH对两株菌降解石油效果的影响环境pH值的变化对微生物的生长和代谢有着重要的作用[18],从图 3可以看出,培养基初始pH值对微生物的生长繁殖及其降解石油效率均产生了不同影响,其中两株菌在pH值 5—9生长良好,A.sp 1在pH值为6时其石油降解率达到最高,A.sp 2在pH值为8时降解率达到最高。
2.5 不同的磷源对两株菌降解石油效果的影响磷是细胞生长的必需元素,也是影响石油降解菌降解效率的重要营养物质[19]。分别选择K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、K2HPO4+KH2PO4作为磷源来确定其最佳磷源。实验结果如图 3所示,两株菌对不同磷源均可利用且石油降解效果较好,尤其当采用K2HPO4和KH2PO4(质量比为1∶1)作为共同磷源时,两株菌的石油降解率均达到最大值。
2.6 接种量对降解石油效果的影响石油降解菌的数量是影响石油降解率的重要因素之一,接种量过多、偏少都不利于菌株对石油烃组分的降解利用。接种量过多会导致微生物种内竞争的加剧,营养物质消耗加速[20],而接种量过少,意味着微生物细胞数量不足。而高浓度石油会对土壤中微生物细胞生长产生抑制作用,影响酶的合成,导致利用石油的周期延长,降解速率降低[21]。当A.sp 1、A.sp 2的接种量在2%—10%时,两株菌均生长良好。A.sp 1在接种量为4%时更有利于对石油的降解,A.sp 2在接种量为8%时有利于对石油的降解(图 4)。
2.7 降解前后石油组分比较分析通过探讨盐浓度、pH值、不同形态的N源与P源,接种量等因素对两株石油降解菌处理石油的影响。分别确定这些因素对两株菌降解石油的最佳降解条件,A.sp 1在盐度1%、pH值6、磷源(K2HPO4和KH2PO4)、氮源为硝酸铵和接种量4%时其最高石油降解率达到60%,A.sp 2在盐度1%、pH值 8、磷源(K2HPO4和KH2PO4)、氮源为尿素和接种量8%时其最高石油降解率可达到67%。为了进一步了解两株菌对原油的不同组分的降解能力,采用GC-MS对微生物降解石油前后的石油烃组分变化进行分析。
石油降解菌A.sp 1、A.sp 2降解7 d后原油组分的GC-MS总离子流图谱,与对照组原油样品的GC-MS图谱进行对比,并结合质谱图图 5,进行定性分析可知:(1)两株菌对不同碳链长度的石油烃类物质均有明显降解效果,且降解效果不尽相同;(2)两株菌均对碳原子数大于20的石油烃类物质有较好的降解效果,其中A.sp 1对C21—C25的石油烃类降解效果较明显,A.sp 2对C20—C30的石油烃类降解效果显著;(3)两株菌对碳原子数小于20的石油烃类物质降解效果较差,原因可能是因为,微生物细胞降解高碳原子数的石油烃类物质组分生成了低碳原子数的石油烃类物质,从而导致后者的含量相对增加,这和以前文献报道一致[22]。
3 讨论从陕北产油区污染土壤中获得两株高效石油降解菌(A.sp 1和A.sp 2),经形态观察、部分生理生化试验和分子学鉴定(16S rDNA特征序列测定)等方法,确定所获得的两株石油降解菌均属于不动杆菌属。本试验进一步分别考察了不同盐浓度、pH值、氮源、磷源、接种量等因素对两株石油降解菌降解石油的影响,确定A.sp 1的最佳石油降解条件为:盐浓度1%、pH值6、磷源(K2HPO4和KH2PO4)、氮源为硝酸铵和接种量4%;A.sp 2的最佳石油降解条件为:盐浓度1%、pH值 8、磷源(K2HPO4和KH2PO4)、氮源为尿素和接种量8%。在各自最佳石油降解条件下,两株菌的石油降解率分别可以达到60%和67%。
通过GC-MS分析方法对微生物降解石油前后的石油烃组分变化进行进一步分析,确定A.sp 1对C21—C25的石油烃类有较好的降解效果,A.sp 2对C20—C30的石油烃类降解效果较好,而且两株菌对大分子的石油烃类有一定的降解效果。与何丽媛[23]等报道混合菌群对石油烃类的降解种类有所不同,其作用的分子和酶学机制目前还没有研究报道,推测可能是这些菌所含有的降解石油烃类的酶系或分子基础不同,而这必然和这些降解菌的种属差异性相关。
据报道,不动杆菌属降解石油的一个关键因素可能和其在降解过程中产生的一种表面活性剂脂肽有关[24],但其相关分子机制和影响其降解效果的因素报道较少[25]。近年来对可能影响其现场降解效果因素的研究备受关注,本文的实验结果有可能为将此类菌株应用于现场修复试验过程中营养盐种类的添加提供了参考[26]。有关其降解过程是否产生表面活性剂以及其作用的机制目前还在研究之中。
石油污染土壤中往往含有高浓度的多种盐类物质,这些盐离子的存在必然影响微生物细胞降解石油的效果。例如,高浓度的钠离子导致细胞外环境渗透压过高,而这会进一步影响微生物原生质膜上的离子种类和数量,可能影响细胞表面的电荷性质和大小,从而可能影响其细胞活性、生长和繁殖,进而可能影响其降解石油的能力和效率。另外,就降解酶作用的分子机制而言,过高的盐浓度可能影响微生物细胞脱氢酶和氧化酶的对外分泌,从而可能影响其对石油组分的降解效果[27]。本文所得菌株在试验盐浓度范围内,甚至在高盐浓度下对所加盐类离子具有耐受性,生长也没有形成强烈抑制,说明这类菌株对高盐浓度有一定的耐受性,在现场修复中有一定的应用前景[26]。
一般情况下,石油污染土壤中的C源非常丰富,石油降解菌利用石油烃污染物作为碳源发生矿化作用和共代谢,但绝大多数土壤中的氮、磷含量都较低,因此,氮源和磷源是常见的烃类生物降解的限制因素[28],在降解过程中,氮源、磷源等营养物质的补充是微生物降解石油,生长的重要条件。本实验发现,当以K2HPO4和KH2PO4为磷源时,更有利于菌株对石油的降解,这可能是由于外源磷源为细胞降解原油提供了有效的营养成分。
另外,氮源对微生物降解石油时的影响作用可能较敏感,有报道认为NH4NO3是动胶菌属细胞降解石油时的优选氮源,而本文发现A.sp 2菌株的最佳氮源为尿素,这种结果的差异可能和菌株的种属特异性有关。本文获得的以尿素为最优氮源的不动杆菌属,相对于使用硝酸铵为氮源的其它菌株而言,更具有经济性,毕竟尿素相对便宜易得。本研究发现,相对添加的氮源种类而言,添加有机氮源没有比无机氮源补充对微生物细胞石油降解作用的影响显著,从理论上讲,有机氮源同时作为碳源,将优先于石油烃类被利用,这可能妨碍了石油烃的高效降解,和以前的研究报道一致[29]。
环境pH值变化对微生物的生理活动影响很大[30],过低的pH值导致环境氢离子浓度超过微生物酶的适应范围,进而引起微生物原生质膜的电荷变化,而pH值过高又会对微生物的生长和降解酶的分泌产生不利影响,最终影响微生物对营养物质的吸收和酶活性。由此可见,过低或过高的pH都可能会使微生物细胞对石油的生物降解速率减慢[27]。从图 3可以看出,A.sp 1在pH值为6时,石油降解率和微生物生长均达到最大值,说明pH值在6左右时,是其降解的最适pH值。而A.sp 2生长和降解的最适pH值为8左右,表明该菌株适合在偏碱环境下生长,这可能是自然选择的结果,因为采样所在地陕北油田地区土壤的pH值为7.6—8.6[31]。
接种量大小对微生物群体生长的延滞期长短和细胞生长速度有一定的影响[32]。本研究表明,A.sp 1在接种量为4%时对石油烃的降解效果较好,A.sp 2在接种量为8%时对石油烃的降解效果较好。当A.sp 1接种量大于4%、A.sp 2接种量大于8%时,菌体之间的相互竞争作用使降解速率降低,同时接种量偏低则可能使微生物处于一种恶劣的生长环境下产生一些抑制自身生长的次级代谢产物甚至导致自身死亡[23]。
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