刺参(Apostichopus japonicus)养殖是我国水产养殖业的重要支柱之一，主要分布在山东和辽宁沿海^[1]。近年来，池塘养殖已经成为刺参人工养殖最主要的方式^[2]。但随着该产业的快速发展，刺参病害问题日益突出，成为该产业持续发展的瓶颈^[3]。研究表明，细菌性疾病在刺参养殖中非常普遍，如腐皮综合症等，它和养殖过程中的一些其他疾病都与养殖环境中的病原菌有关^[4]。细菌性疾病用药防治只是暂时性手段，生态防治才是解决问题的长久有效途径^[5]。微生物在养殖生态系统的物质循环和能量流动以及污染环境的改善修复中扮演了重要角色，它们和养殖生物有着密切的关系，常常也是养殖对象的病原或条件致病性病原^{[6, 7]}。而微生物群落的生态功能特征能够反映环境的健康状况，因此，养殖生态系统中微生物群落的功能多样性研究具有十分重要的意义。

BIOLOG技术通过测定微生物对不同碳源利用程度的差异来表征其功能多样性，是目前微生物功能多样性研究的常用方法，在研究空间及时间尺度上微生物群落变化方面有较好的应用，能够有效地评价不同环境区系微生物群落特征^{[8, 9, 10]}。近年来，BIOLOG技术在研究水产养殖环境中微生物群落方面已有所报道^{[11, 12]}，但研究多集中于鱼、对虾等方面，对于刺参却报道甚少。刺参属于底栖低温生物，生长适宜温度范围为12—20 ℃，因此具有在春秋两季活动生长、夏冬两季休眠的生理特性^{[13, 14]}；此外，刺参养殖过程中需在池塘底部设置大量人工附着基以供刺参附着栖息摄食^[15]。因此，刺参池塘底质生态系统不同于其他环境系统，刺参的季节性活动摄食以及其主要活动场所-附着基的设置使其微生物群落特征具有特殊性。本研究利用BIOLOG ECO微平板培养法首次探讨了刺参养殖池塘底泥和附着基环境微生物群落功能多样性的季节变化及其与环境因子间的关系，以期对刺参池塘底质微生态调控模式的建立提供基础资料。

实验采样地为山东省青岛市胶南的3个刺参养殖池塘。分别于2011年4月(春季)、7月(夏季)、10月(秋季)和2012年1月(冬季)各季度月下旬用无菌器皿采集池塘底泥和附着基样品。用采泥器在各个池塘的5处不同位置采表层底泥(0—5 cm)，放入已灭菌的样品袋中；将各个池塘5处不同位置的附着基(包括瓦片、地笼和水泥砖)取出水面，用已灭菌的刀片刮取附着基表面的泥，放入己灭菌的样品袋中。将各类样品用4 ℃保温箱带回实验室分析。实验分析时每个池塘的每种样品均为随机采取的5个点的混合样。

样品(包括底泥和附着基)测定的主要常规指标包括总有机碳(TOC)、总氮(TN)、总磷(TP)、有机质(SOM%)、氨态氮(NH₄-N)、硝态氮(NO₃-N)和活性磷酸盐(PO₄-P)。TOC和TN采用元素分析仪同时测定，TP采用过硫酸钾(K₂S₂O₈)氧化法测定^[16]，SOM%采用马弗炉灼烧法测定^[17]，NH₄-N和NO₃-N以2 mol/L KCl溶液浸提后分别采用靛酚蓝法和镉柱还原法测定^{[18, 19]}，PO₄-P用0.5 mol/L NaHCO₃溶液浸提、钼锑抗比色法测定^{[18, 19]}。

采用含有31种碳源底物的BIOLOG-ECO板(Biolog Inc. Hayward,C. A.,USA)研究分析微生物群落的碳代谢特征，即功能多样性。根据碳源的化学官能团及微生物生理代谢途径等可将ECO板上的31种碳源划分为6大类^[20]：聚合物4种、糖类10种、羧酸7种、氨基酸6种、酚2种、胺2种。BIOLOG实验在取样后4 h内进行。实验方法参照参考文献^[21]的方法并略作修改，具体操作步骤如下：称取相当于10 g干重的新鲜底泥或附着基样品置于250 mL的无菌三角瓶中，加入90 mL灭菌的0.85%(质量比)生理盐水，制成10^-1的样品悬浊液，将此悬液在4 ℃摇床上震荡1 h，静置10 min后取上清液进行10倍梯度稀释至10^-2或10^-3(根据BIOLOG-ECO板的接种浓度要求，使每个样品悬液里的细菌数量在(1—5)×10⁴ CFU/mL)，然后取150 SymbolmA@L样品悬液接种至ECO板的每一个孔中，对照孔加入150 SymbolmA@L的无菌水，将接种好的板置于25 ℃恒温培养7d，于0、24、48、72、96、120、144、168时，用酶标仪分别在590 nm和750 nm下测定光密度值。

平均颜色变化率(AWCD)是反映微生物利用单一(类)碳源能力的重要指标，其计算方法^[22]如下：

式中，C_i为所测定的第i个碳源孔的光密度值，R为对照孔的光密度值，n为培养基碳源种类数。本研究n取值随所研究碳源种类数变化，分别为31(全部碳源)、4(聚合物)、10(糖类)、7(羧酸)、6(氨基酸)、2(酚)、2(胺)。公式表示单个碳源孔在590 nm与750 nm的光密度差值，即为单孔实际光密度值，其中数值小于0.06时按0处理。

本研究用培养72 h的BIOLOG数据来计算微生物群落利用不同类型碳源的强度(AWCD)、功能多样性指数、主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。其中，多样性指数的计算参照植物生态学的方法^[23]，包括：

Shannon指数(H′)，用于评估微生物的丰富度和均度，其计算公式为：H′= -∑P_ilnP_i，式中，P_i=n_i/N，n_i为第i种碳源孔的实际光密度值，N为样品中所有碳源孔实际光密度值的总和。

S-E均匀度指数(S-E)，为通过Shannon指数计算出的均度，S-E=H′/lnS，式中S为颜色变化孔的数目。

McIntosh指数(U)，为基于群落物种多维空间上的多样性指数，其计算公式为U=√(∑n_i²)。

Simpson指数(D)，用于评估最常见种的优势度，其计算公式为D=1-∑(P_i)²。

采用主成分分析(PCA)和单因子方差分析(One-way ANOVA)确定不同季节期间微生物群落碳代谢特征是否有显著差异。主成分分析所用分析数据为各碳源孔的相对光密度值P_i。用主成分分析结果中各碳源光密度值与主成分得分系数的相关系数确定31种碳源与主成分的关系。应用冗余分析(RDA)确定不同季节微生物群落碳代谢功能多样性与环境因子间的相互关系。冗余分析所用数据均经过lg(x+1)转换。数据统计、主成分分析、方差分析采用SPSS 13.0软件进行，绘图在EXCELL 2010中完成，冗余分析及其排序图绘制采用CANOCO 4.5软件一并完成。数据显著性水平确定为P<0.05。

考察刺参池塘底质微生物利用ECO板上全部碳源的AWCD可知(图 1)，底泥和附着基微生物利用碳源的总量均随着培养时间的延长呈现逐渐增加的趋势，且具有明显的季节变化。具体表现为：在培养24 h后，各类微生物不同季节间的AWCD值开始出现分化，之后差异愈明显。底泥微生物各培养阶段的AWCD值表现为春、夏、秋季节明显高于冬季，而且从最终的培养结果来看夏季要较高于春、秋季节(图 1)；附着基微生物各培养阶段的AWCD值为春、夏、秋季节明显高于冬季，春、夏、秋季节之间差异不大，但从总体表现以及最终的培养结果来看秋季要较高于春、夏季节(图 1)。

图 1 2009年和2010年童庄河回水区拟多甲藻密度的时空变化 Fig. 1 Seasonal variations of average well color development (AWCD) in all carbon sources utilized by soil microbial communities in sea cucumber cultural ponds

图选项

考察刺参池塘底质微生物利用ECO板上不同类型碳源的AWCD可以看出(图 2)，底泥和附着基微生物对聚合物、糖类、羧酸、氨基酸、酚、胺的利用强度均存在显著的季节变化(P<0.05)。

图 2 刺参池塘底质微生物利用不同类型碳源平均颜色变化率(AWCD)的季节变化 Fig. 2 Seasonal variations of average well color development (AWCD) in different types of carbon sources utilized by soil microbial communities in sea cucumber cultural ponds

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底泥微生物在春、秋季节均以利用聚合物、糖类和羧酸为主，夏季以利用聚合物、糖类和氨基酸为主，冬季对各类碳源的利用强度均不高；比较发现，底泥微生物对各类碳源的利用强度均存在显著的季节变化(P<0.05)。对聚合物的利用强度在春、秋季节显著高于夏、冬季节； 冬季显著低于夏季。对糖类的利用强度在春、夏、秋季节均显著高于冬季。对羧酸的利用强度在春、秋季节均显著高于夏季。对氨基酸的利用强度以夏季显著高于其他季节；春季显著高于秋、冬季节。对酚的利用强度以春、秋、冬季节均显著高于夏季。对胺的利用强度在春、夏季节均显著高于秋、冬季节(图 2)。

附着基微生物对各类碳源的利用特征在春、夏、秋季节相似，均以利用聚合物、糖类和氨基酸为主，其中春、秋季节也对胺类物质有较高的利用，而冬季对各类碳源的利用强度均不高；比较发现，附着基微生物对各类碳源(酚除外)的利用强度均存在显著的季节变化(P<0.05)。对聚合物的利用强度在秋季显著高于夏、冬季节； 春、夏季均显著高于冬季。对糖类的利用强度在春、夏、秋季节均显著高于冬季。对羧酸的利用强度在春、夏、秋均显著高于冬季。对氨基酸的利用强度以春、秋季节均显著高于其他季节；夏季显著高于冬季。对胺的利用强度在春、秋季节均显著高于夏、冬季节；冬季显著低于夏季(图 2)。

研究刺参池塘底质微生物群落对31种碳源利用的主成分分析结果(图 3)表明：底泥和附着基微生物群落碳源利用方式均存在显著的季节变化(P<0.05)。主成分得分系数方差分析的结果发现：底泥和附着基微生物主成分1和主成分2得分系数差异均显著(P<0.05)。底泥微生物PC1得分系数差异表现在夏季与其他季节之间有显著差异，PC2得分系数差异表现在春、夏、冬季节之间以及秋季与冬季之间有显著差异(图 3)。附着基微生物PC1得分系数差异表现在春季与冬季、秋季与冬季、夏季与秋季之间均有显著差异，PC2得分系数差异表现在春、夏季节与冬季的差异均达到显著水平(图 3)。

图 3 刺参池塘底质微生物碳源利用类型季节变化的主成分分析 Fig. 3 Principal components analysis (PCA) of seasonal variations of carbon utilization profiles of soil microbial communities in sea cucumber cultural ponds

图选项

与主成分1、2具有较高相关系数(r > 0.6)的碳源见表 1。底泥中，对PC1起分异作用的碳源主要有13种，分别属于糖类(5种)、羧酸(3种)、氨基酸(3种)、酚(2种)，说明有13种碳源使不同季节底泥微生物群落碳代谢功能多样性在PC1上差异显著(P<0.05)；对PC2起分异作用的碳源主要有5种，分别属于聚合物(2种)、糖类(2种)、羧酸(1种)，说明有5种碳源使不同季节底泥微生物群落碳代谢功能多样性在PC2上差异显著(P<0.05)。同样，附着基上，决定PC1分异的碳源主要有20种，分别属于聚合物(4种)、糖类(6种)、羧酸(4种)、氨基酸(4种)、酚(1种)、胺(1种)；决定PC2分异的碳源主要有2种，皆属于羧酸类(2种)。

表 2列出了刺参池塘底质微生物在培养72 h后所利用碳源的多样性指数，包括Shannon指数、McIntosh指数、Simpson指数、S-E均匀度。结果表明，底泥和附着基微生物群落的多样性指数具有显著的季节变化(P<0.05)。对于Shannon指数，底泥中，春、夏、秋、冬呈现依次递增的趋势，冬季显著高于其他季节；附着基中春、夏、秋季节差别不大(P>0.05)，但均显著低于冬季。而McIntosh指数的变化与Shannon指数正相反，显著性分析结果表明：底泥中，冬季显著低于其他季节，且春季显著高于夏、秋季节；附着基中，冬季显著低于其他季节，且春、秋季节均显著高于夏季。对于Simpson指数而言，底泥中，春季最低，冬季最高，且冬季显著高于春季；附着基中，春、夏、秋季节差别不大(P>0.05)，但均显著高于冬季。S-E均匀度的变化在各个季节差异很大，具体表现在：底泥中，以夏季显著低于其他季节，秋季显著高于其他季节；附着基中，春、夏、秋、冬呈现先降低后升高的趋势，以夏季最低，冬季最高，各个季节之间差异显著。

刺参池塘底质环境因子指标的季节变化结果(表 3)显示，底泥和附着基各环境因子指标具有显著的季节变化(P<0.05)。TOC含量在底泥中以春季显著高于其他季节，而在附着基中随春、夏、秋、冬呈现显著升高的趋势。TN含量在底泥和附着基中的季节变化与TOC基本相同。TP含量在底泥和附着基中随春、夏、秋、冬均呈现显著升高的趋势。NH₄-N含量在底泥中以冬季显著高于其他季节，春季显著高于夏秋季节；而在附着基中呈现相反的季节变化，以秋季显著高于其他季节，夏季显著高于春冬季节，春季显著高于冬季。NO₃-N含量在底泥中以春、夏、秋均显著高于冬季；而在附着基中以冬季显著高于其他季节，夏季显著低于春、秋季节。PO₄-P含量在底泥中以夏、冬季显著高于春、秋季节；而在附着基中随春、夏、秋呈显著升高的趋势，至冬季降低，显著低于其他季节。SOM含量在底泥中无显著季节变化；而在附着基中随春、夏、秋、冬呈显著升高的趋势。

图 4从整体上反映了刺参池塘底质微生物功能多样性(包括对全部和不同类型碳源的利用能力以及碳代谢多样性指数)的季节变化与7种环境因子变量之间的关系。底泥中，RDA排序图(图 4)的两个主要轴(第一、第二排序轴)的特征值分别为0.786和0.196；对于微生物功能多样性或者环境因子指标而言，第一、第二排序轴之间的相关系数均为0，表明这2个轴相互垂直，这些说明RDA分析的排序结果是可信的^[24]。从排序结果可以得到，底泥微生物群落功能多样性的季节变化差异非常明显，冬、春两季分别位于第一排序轴的正端和负端，夏、秋分别位于第二排序轴的正端和负端。第一轴排序与TP(相关系数为0.904)、PO₄-P(0.570)、NH₄-N(0.451)正相关，与NO₃-N(-0.805)、TOC(-0.760)、TN(-0.686)、SOM(-0.251)负相关；第二轴排序与PO₄-P(0.812)、NH₄-N(0.008)正相关，与TN(-0.661)、TOC(-0.464)、SOM(-0.280)、NO₃-N(-0.170)、TP(-0.149)负相关。这表明，底泥微生物功能多样性季节变化的主要影响环境因子为TP、NO₃-N和PO₄-P。其中，TP主要对Shannon(正相关)、AWCD(负相关)、McIntosh(负相关)、Carh(负相关)等表征微生物功能多样性的指标产生较高影响；NO₃-N主要对AWCD(正相关)、McIntosh(正相关)、Shannon(负相关)等产生影响；PO₄-P主要对Simpson(正相关)、Poly(负相关)等产生影响。附着基中，RDA排序图(图 4)第一、第二轴的特征值分别为0.982和0.015，且两轴之间的相关系数均为0，表明这2个轴相互垂直。从排序结果可以发现，附着基微生物群落功能多样性的季节变化表现为：春、秋两季相似，位于第一排序轴的负端，冬季位于第一排序轴的正端，夏季位于第二排序轴的正端。第一轴排序与SOM(0.912)、NO₃-N(0.874)、TN(0.834)、TP(0.740)、TOC(0.731)正相关，与NH₄-N(-0.618)、PO₄-P(-0.576)负相关；第二轴排序与TP(0.065)正相关，与TOC(-0.496)、NO₃-N(-0.463)、TN(-0.416)、NH₄-N(-0.358)、PO₄-P(-0.356)、SOM(-0.288)负相关。因此，附着基微生物功能多样性季节变化的主要影响环境因子为SOM、NO₃-N和TN。其中，SOM主要影响Carh(负相关)、McIntosh(负相关)、Poly(负相关)、AWCD(负相关)等功能多样性指标；NO₃-N和TN均主要影响Shannon(正相关)、Carh(负相关)、Carx(负相关)、Simpson(负相关)等指标。研究表明，底泥和附着基微生物群落功能多样性具有显著的不同的季节变化，与环境因子具有很好的相关性，但二者与环境因子(TP除外)相关关系基本相反。

图 4 刺参池塘底质微生物碳代谢功能多样性季节变化与环境因子的RDA分析 Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) of seasonal variations of carbon metabolic function of soil microbial communities in sea cucumber cultural ponds with environmental factors

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BIOLOG微平板培养法可以根据微孔颜色变化情况来评估微生物群落状况^[9]。本研究中刺参池塘底泥和附着基微生物群落对碳源总量和不同类型碳源的利用均存在显著的季节性变化(图 1，图 2)，这说明它们的碳代谢能力存在季节性差异，也进一步反映了它们微生物群落结构组成的季节性变动^[11]。BIOLOG的主成分分析是反映微生物群落结构功能特征的有效手段^[25]。本研究对31种碳源利用的PCA分析发现底泥和附着基微生物群落碳源利用方式均存在显著性季节变化(图 3)，这充分证实了刺参池塘底质微生物群落在代谢功能和结构特征上的季节变动。微生物群落多样性指数是反映物种丰富度和均匀度的综合指标，其变化能够准确反映群落功能多样性总体的动态变化，但采用的多样性指数不同，研究结果也存在较大差异^[26]。本研究中，Shannon指数在冬季较高，其他季节尤其是春、夏季节特别低，而McIntosh指数的变化规律与此相反(表 2)。这可能是因为春、夏季节存在优势菌群从而使它们物种的丰富度或均匀度不高而导致Shannon指数较低，但同时优势菌群的存在也能大大提高群落对某一(些)类碳源的利用喜好和利用程度，从而导致McIntosh指数较高^{[11, 27]}。而S-E均匀度的季节变化也能在很大程度上推测到春、夏季节优势菌群的存在(表 2)。研究还发现，Simpson指数不同于其他多样性指数，其在底泥和附着基中的季节变化具有较大差异(表 2)。同样，微生物群落对碳源利用的季节变化在底泥和附着基中也存在较多差异(图 1—图 3)，这些说明底泥和附着基微生物群落功能多样性的不同。

微生物群落功能多样性是其环境因子的反映，与环境理化性质紧密相关，且相互影响^[28]。RDA分析发现，底泥和附着基微生物群落功能多样性的季节变化与环境因子的季节变化具有很好的相关性，但二者与环境因子(TP除外)具有完全相反的关系，且影响它们的主要环境因子也不同，这些进一步说明它们在功能多样性上的差异。本研究中TP、NO₃-N和PO₄-P三者与底泥微生物群落功能多样性指标呈现最大相关性，是底泥微生物群落变化的主要影响因子，这进一步证明了N、P是影响土壤微生物群落的重要因素^{[29, 30]}；而SOM、NO₃-N和TN是附着基微生物群落变化的主要影响因子，这表明C、N对附着基微生物的重要性，也进一步证明了C是影响底流微生物群落的重要因素^[31]。微生物生长对养分的需求趋向于有较高的C、N、P含量^[32]。本研究中N是影响底泥和附着基微生物群落季节变化的共同因素，这可能是参与氮循环微生物群落对N的利用的结果，这进一步表明微生物氮循环以及氮循环微生物群落在整个生态系统中的重要地位^[33]。

在对本实验刺参池塘的前期研究中发现，附着基和底泥微生物群落结构区系组成具有不同的季节变化^[34]，这从根本上解释了它们的功能多样性季节变化的差异。而造成这些差异的原因可能在于池塘附着基和底泥自身环境的不同以及刺参摄食活动的影响等。具体表现在：(1)由于海水中营养物匮乏，而浸水固体表面粘附大量有机物，故许多海洋细菌都具有粘附在固体表面的特性。研究认为，具有鞭毛的细菌易于附着^[35]，因此附着基上的细菌种类多是附着能力较强的种类，不同于底泥中的细菌组成^[34]。(2)附着基浸于水体中，处于池塘环境的底流区，其表面的透气性要远高于底泥，因此，附着基上的细菌种类可能以好氧性细菌种类居多，不同于底泥。(3)附着基是刺参主要的栖息地和摄食活动场所，刺参主要摄食附着基上繁生的底栖硅藻、原生动物、某些细菌等微小生物及附着其上的有机碎屑^[15]。这些生物与微生物群落之间具有复杂的关系，例如底栖硅藻与微生物之间对N、P等营养盐的竞争利用、原生动物与细菌之间摄食与被摄食，刺参对它们的大量摄食可能改变了这些关系进而对微生物群落结构功能产生直接或间接的影响；另外，生物死亡残骸也为微生物生长繁殖提供有机养料，因此刺参的摄食可能最终导致附着基上有机物相对缺乏，限制了微生物的代谢生长从而使C成为影响附着基微生物群落结构功能多样性的主要因素之一。另一方面，春、秋季节是刺参的摄食活动期，而本研究中春、秋季节附着基微生物群落功能多样性基本相似(图 4)，不同于底泥，因此可推测刺参活动对附着基微生物群落功能产生了一定的影响。

微生物群落功能多样性的季节变化也会受温度等物理环境因子的影响，如本研究中春、夏、秋季节底泥和附着基微生物碳代谢活性差别不大，但均明显高于冬季(图 1)，这很可能是由于冬季温度太低而导致其微生物整体代谢活性不高。但考虑到营养盐是微生物生长的物质基础，是养殖环境改善修复的主要对象，本研究重点考察了刺参池塘底质微生物功能多样性季节变化与化学环境因子间的关系。研究认为，刺参池塘底泥和附着基微生物功能多样性具有显著的不同的季节变化，这些变化与环境因子具有很好的相关性；底泥和附着基微生物功能多样性季节变化差异可能与自身环境以及刺参的摄食活动有关；本研究为刺参池塘微生态调控模式的建立提供了基础资料。但是由于微生物群落结构与功能多样性的复杂性，以及BIOLOG方法本身存在一定的缺陷^[8]，今后还需结合分子生物学及其他方法进行才能更有效全面的揭示微生物的生态功能。