2014, Vol. 34文章信息
- 王祎, 张月玲, 苏建伟, 李慧, 王宜伦, 苗玉红, 谭金芳, 韩燕来
- WANG Yi, ZHANG Yueling, SU Jianwei, LI Hui, WANG Yilun, MIAO Yuhong, TAN Jinfang, HAN Yanlai
- 施钾提高蚜害诱导的小麦茉莉酸含量和叶片相关防御酶活性
- Potassium application for increased jasmonic acid content and defense enzyme activities of wheat leaves infested by aphids
- 生态学报, 2014, 34(10): 2539-2547
- Acta Ecologica Sinica, 2014, 34(10): 2539-2547
- http://dx.doi.org/10.5846/stxb201305171100
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文章历史
- 收稿日期：2013-5-17
- 网络出版日期：2014-2-20
2. 河南农业大学资源与环境学院, 郑州 450002;
3. 中国科学院动物研究所, 农业虫鼠害综合治理国家重点实验室, 北京 100101
2. College of Resource and Environment, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
3. State Key Laboratory of Integrated Management of Pest Insects and Rodents, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
小麦是世界上种植面积仅次于水稻的粮食作物，在世界和我国粮食安全中起着非常重要的作用。蚜虫是小麦产区常发性害虫之一，具有分布广，发生量大等特点，严重威胁小麦生产[1]。杨益众[2]等人曾报道，麦蚜危害后可使小麦穗粒数减少18.60％，千粒重下降45.24％，秕粒数达到30.19％。目前对小麦蚜虫的防治多采用化学农药，不仅加重农民负担、造成环境污染，还会使蚜虫产生抗药性[3]。植物的耐虫性受多种因素的影响，土壤中的氮、磷、钾等营养状况是其中的重要因子之一[4]。关于钾与作物抗蚜性的关系，国内外在小麦[5, 6, 7, 8]、大豆[9, 10, 11]、棉花[12]、百合[13]、大麦[14]等作物中均有报道。但是，目前对施钾增强植物抗蚜性的机理研究尚不深入。
植物遭受昆虫攻击时，不同植物会通过诱导不同的信号途径来抵御其侵食，信号分子在植物化学信号传导过程中对抗虫反应起着非常重要的作用[15]。目前研究较多的信号分子主要是茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、乙烯(ET)和活性氧。JA和SA是植物诱导防御反应的重要信号分子，在代谢调控、防御反应、信号交互等方面发挥着重要的作用。植物受到植食性昆虫危害后，能够导致内源茉莉酸水平的增加，并且改变防御途径关键酶的活力或者产生大量防御蛋白来保护自身[16]。脂氧合酶(LOX)不仅是JA合成的关键酶，同时也是植物诱导防御的重要物质。而JA合成后与膜上的受体相结合而启动防御基因的转译以及其他由JA介导的反应，并由此产生防御蛋白或防御酶如多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、几丁质酶等 [17]，增强植物对虫害的诱导抗性。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，在酚类化合物合成中起关键作用[18]。诸多研究表明，LOX、PPO、PAL和POD等防御酶在作物诱导的抗蚜反应中发挥着重要作用，其活性的高低与抗蚜性有直接关系[19, 20, 21, 22, 23]。
Mayer[9] 等和Walter[11]等研究发现，充足供钾可抑制大豆蚜虫的发生。本课题组前期研究发现充足供钾可以增强小麦对蚜虫的抗性[8]，本试验通过研究钾对蚜虫取食后小麦叶片内源茉莉酸和水杨酸含量的变化以及防御性酶活性的动态变化，探讨钾影响小麦抗蚜性的效应机制，以期为钾肥的合理施用和小麦蚜虫的综合防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试小麦品种为河南省主栽品种郑麦9023。
1.2 方法 1.2.1 试验设计采用营养液培养小麦植株，设置低钾0.005 mmol/L和高钾2 mmol/L两个钾水平。选取颗粒饱满的小麦种子经0.5％的次氯酸钠溶液消毒10min，蒸馏水冲洗3—4次后，浸水吸胀12 h，将浸泡后的种子放入高温杀菌过的细沙中培养，7 d后选取长势一致的麦苗，洗净后转移到含3 L营养液的小桶中于25 ℃、12 h光照条件下继续培养，20 d后分别进行接虫和不接虫处理。营养液配方(杨振明营养液，mmol/L)：Ca(NO3)2·4H2O (0.6)，NH4NO3 (0.8)，CaCl2 (2.6)，MgSO4·7H2O (0.3)，(NH4)2HPO4 (0.28)，NH4H2PO4 (0.64)，钾用K2SO4提供。微量元素配方(mmol/L)：CuSO4·5H2O (0.001)，ZnSO4·7H2O (0.001)，H3BO3 (0.033)，MnSO4 (0.01)，(NH4)6Mo7O2·4H2O (0.0002)，EDTA-Fe2+ (0.05)。每两天更换1次营养液。
1.2.2 蚜虫接种接虫前，在郑州郊区大田捕捉麦长管蚜虫Sitobion avenae (Fabricius) 若虫，参照鲁艳辉[24]的饲喂条件，在人工气候箱内饲喂，光照 17 h/ 7 h(昼/夜)，温度20 ℃，湿度60%，待长至成虫后，挑选个体大小一致的蚜虫进行接种，每株小麦接种蚜虫20头。
1.2.3 样品的采集与处理分别于接虫后0、12、24、48、72、96 h，采集小麦最新展开叶，放入液氮罐中保存，用于POD、LOX、PAL、PPO活性的测定。采集接虫48 h的新鲜小麦叶片用于茉莉酸和水杨酸含量的测定。
1.2.4 酶液的提取与测定(1)脂氧合酶活性测定 参照姚锋先[25]的方法，略有改动。取0.2 g新鲜小麦样品，加7 mL经4 ℃预冷的0. 1 mol/L(pH值7.6)的Tris-HCl缓冲液冰浴上研磨。4 ℃、12000 r /min离心25 min，上层清液即为LOX酶提取液。以2.4 mL 0.1 g/L亚油酸作为底物，加入0.1 mL 酶液，在234 nm处测定吸光度值，每隔30 s读数1次，共测5 min。LOX酶活性以每分钟在234 nm处吸光度变化0.01 OD作为一个酶活力单位。
(2)多酚氧化酶活性测定 参照吕敏[26]的方法，略有改动。称取新鲜小麦样品0.5 g放入预冷过的瓷研钵中，加入6 mL 0.1 mol/L(pH值6.8)磷酸缓冲液，加入适量石英砂，冰浴研磨。4 ℃，10000 r/min离心20 min，取上清液即为酶提取液。反应体系中加入2.9 mL含0.02 mol/L邻苯二酚的磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH值6.8磷酸缓冲液)，加入0.1 mL酶提液于30 ℃水浴反应30 min后，记录410 nm处的吸光度变化，以不加酶液而加相同体积缓冲液为空白对照。PPO酶活性以每小时在410 nm处吸光度变化0.01 OD作为一个活力单位。
(3)苯丙氨酸解氨酶活性测定 参照李合生[27]的方法，略有改动。称取新鲜小麦样品0.5 g放入预冷过的瓷研钵中，加入6 mL 0.1 mol/L(pH值8.8)硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4 ℃冰箱中浸提4 h。4 ℃，10000 r/min离心20 min，取上清液即为酶提取液。吸取酶液0.2 mL，加入1 mL由硼酸钠缓冲溶液配制的0.1 mol/L L-苯丙氨酸，2.8 mL蒸馏水，摇匀，在40 ℃水浴上反应30 min，冰浴中止反应，测定OD290nm值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL酶活性以每小时在290 nm处吸光度变化0.01 OD作为1个活力单位。
(4)过氧化物酶活性测定 参照李合生[27]的方法，采用愈创木酚法进行测定，略作改进。称取新鲜小麦样品0.5 g放入预冷的瓷研钵中，加入预冷的0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH值8.5)，研磨成匀浆，转入离心管中，4 ℃浸提4 h，10000 r/min离心20 min，取上清液即为酶提取液。POD酶活性测定：取酶液0.1 mL，加入3.5 mL含0.5 mol/L愈创木酚的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH值 5.8)，50 μL 2.5% H2O2，在30 ℃水浴保温15 min后，以不加酶液而加相同体积的缓冲液为空白对照，470 nm处测定吸光值，每隔30 s记录1次吸光度，共测4 min。POD酶活性以每分钟在470 nm处吸光度变化0.01 OD作为1个酶活力单位。
1.2.5 茉莉酸含量的测定参照任琴[28]的方法，略作修改。
(1)茉莉酸样品的制备 取小麦新鲜叶片约0.5 g，加入少量80%预冷甲醇冰浴研磨，浸泡过夜。分别加入8 μL 25 ng/μL内标9,10-二氢茉莉酸(DHJA)，对样品进行抽滤，弃残渣，将滤液加1—2滴氨水后浓缩至水相，反复冻融3次，10000 r/min离心10 min，上清液用聚乙烯吡咯烷酮搅浆，摇匀后放10 min，抽滤。调pH值至2.5—3.0后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，加1滴氨水，35—40 ℃下真空浓缩至干。用0.1 mol/L的醋酸溶解蒸发瓶内的残留物，过C18小柱(Part No. WAT051910)进行纯化、浓缩处理后转入毛细管封存，用于GC/MS测定。
(2)茉莉酸的定性和定量分析 用GC(Agilent Technologies,6890N Network GC System)/MS(Agilent Technologies,5973 Network,Mass selective Detector)对内源茉莉酸进行定性分析。气相色谱柱为HP-5-MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。GC程序升温条件：仪器初始温度为50 ℃，速率20 ℃/min升至180 ℃后，保持4 min，再以10 ℃/min升至290 ℃，保持15 min。GC进样口温度280 ℃，进样体积2 μL。MS仪器接口温度为250 ℃，离子源温度及轰击源分别为200 ℃，70 ev。以0.4 s/次扫描速度进行全扫描，扫描范围为m/z 29—450。
内标DHJA(Dihydro-Jasmonic acid，Sigma，纯度>95%)的选择特征离子(m/z)为：153、226；Me-JA的选择特征离子(m/z)为：151、224。叶中内源茉莉酸的含量NJA(ng/g)=S/Ss×Ms/ W/6，计算公式中，S是内源峰面积；Ss是内标峰面积；Ms是加入的内标量；W是小麦称样量。
1.2.6 水杨酸含量的测定[28](1)水杨酸样品的制备 称取新鲜小麦叶片约0.5 g，加入4 mL 90%甲醇冰上研磨后转移到10 mL离心管中，-20 ℃静置过夜。7500 r/min离心20 min，上清液移入新的离心管中，沉淀加入2 mL 100%甲醇重悬、离心。合并上清，通风橱中65 ℃水浴风干水相。加入5%三氯乙酸(TCA)1.5 mL，摇匀，7500 g离心15 min，取上清。加3 mL环己烷:乙酸乙酯(1∶1)萃取3次。上层有机相60 ℃水浴风干(游离SA)。用乙腈500 μL溶解，过0.2 μm 滤膜。
(2)水杨酸的定量分析 采用高效液相色谱HPLC(Agilent公司HP 1100)测定SA。色谱柱为Agilent-C18反相色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)。梯度洗脱为5 min 100％醋酸水，30 min乙腈∶醋酸水(60∶40)，35 min乙腈∶醋酸水(80∶20)，40 min乙腈:醋酸水(0∶100)，流速0.7 mL/min，吸收光405 nm，激发光295 nm，上样量为20 μL。采用外标法进行定量，SA标准品SALICYLIC ACID (P)购自Chromadex，纯度99.1%。叶中水杨酸的含量NSA(ng/g)=N×V×n/W，计算公式中，N是样品的浓度；V是上样体积；n是分取倍数；W是小麦称样量。
1.3 数据统计分析文中所有试验均设3个生物学重复，试验数据采用DPS v7.05和SPSS11.5软件进行双因子可重复方差分析。
2 结果与分析 2.1 施钾对蚜虫取食后茉莉酸和水杨酸含量的影响从表1可以看出，不接虫时，高钾小麦叶片茉莉酸含量显著高于低钾处理(P<0.05)。虫害48 h后，低钾条件下，茉莉酸的含量没有明显变化，而在高钾(2 mmol/L)条件下，茉莉酸含量比不接虫处理增加了32.2%，比低钾胁迫小麦增加了50.0%，均达到了极显著差异(P<0.01)。表1显示，不接虫时，低钾导致小麦体内水杨酸含量极显著降低，比充足供钾小麦叶片水杨酸含量降低18.5%。接虫48 h后，低钾小麦叶片水杨酸含量显著上升，而高钾小麦水杨酸含量没有显著变化，钾水平间差异也不显著(P>0.05)。
2.2 施钾对蚜虫为害后小麦叶片LOX酶活性的影响不同钾水平培养的小麦植株接种蚜虫后叶片LOX酶活性变化如图1。试验结果表明，不接虫处理下，低钾小麦的LOX酶活性显著高于高钾小麦植株。接种蚜虫后，低钾小麦植株LOX酶活性，与不接虫对照相比没有显著差异。高钾(2 mmol/L)处理的小麦植株在接种蚜虫24 h后LOX酶活性增加，在48 h达到最高值，是不接虫对照酶活性的3.6倍。之后，随着接虫时间的延长，LOX酶活性降低，但仍然显著高于不接虫处理。
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| 图 1 不同处理小麦叶片LOX酶活性变化 Fig. 1 Changes of LOX activities in wheat leaves under different treatments |
| 处理Treatment | 茉莉酸含量JA content/(ng/g) | 水杨酸含量SA content/(ng/g) | |
| 表中数据为3个重复的平均值±SE；数据后括号外小写字母表示同一钾水平下，不同接虫处理之间的JA或SA含量差异达P<0.05的显著水平；括号内小写字母表示相同接虫处理下，不同钾水平之间的JA或SA含量差异达P<0.05的显著水平 | |||
| K1 | 不接虫no aphid infested | 63.64±0.89a (b) | 142.69±3.85a (b) |
| 接虫aphid infested for 48 h | 71.48±5.88a (b) | 167.49±6.94b (a) | |
| K2 | 不接虫 no aphid infested | 81.11±5.53b (a) | 175.09±4.95a (a) |
| 接虫 aphid infested for 48 h | 107.25±0.70a (a) | 174.76±10.04a (a) | |
接种蚜虫后，不同钾水平培养的小麦叶片多酚氧化酶活性变化如图2。试验结果表明，不接虫时，低钾处理的小麦叶片PPO酶活性与高钾小麦植株没有显著差异。接种蚜虫后，低钾小麦的PPO酶活性与对照没有显著差异。接蚜72 h后，高钾处理的小麦叶片PPO酶活性显著高于不接虫对照，活性增加了25.8%，但是其它时间点上与对照没有显著差异。
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| 图 2 不同处理小麦叶PPO活性动态变化 Fig. 2 Changes of PPO activities in wheat leaves under different treatments |
接种蚜虫后，不同钾水平培养的小麦叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化如图3。试验结果表明，不接虫时，低钾处理的小麦叶片PAL酶活性与高钾小麦没有显著差异。接种蚜虫后，低钾小麦叶片PAL酶活性与不接虫对照相比没有显著差异。接虫12 h后，高钾小麦叶片PAL酶活性增加，并且在接虫24 h时活性增加了69.9%，极显著高于不接虫处理。其他时间点上接虫处理对PAL酶活性没有显著影响。
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| 图 3 不同处理小麦叶PAL活性动态变化 Fig. 3 Changes of PAL activities in wheat leaves under different treatments |
接种蚜虫后，不同钾水平培养的小麦叶片过氧化物酶(POD)活性变化如图4。试验结果表明，不接虫时，低钾处理的小麦叶片POD活性显著高于高钾小麦植株。接种蚜虫后，低钾小麦叶片POD酶活性与不接虫对照相比没有显著差异。但是，接虫后高钾小麦叶片的POD酶活性显著提高，在72 h时达到最高，其酶活性是不接虫对照的3.0倍，并且活性增加持续较长时间，保持到接虫后96 h。
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| 图 4 不同处理小麦叶POD活性动态变化 Fig. 4 Changes of POD activities in wheat leaves under different treatments |
植物受到害虫侵害后，细胞会产生一系列信号物质传输到其它未受损伤组织，使整个植株对随后虫害的抗性增加。但是昆虫取食方式不同，诱发的防御反应的类型也不同。一般认为，茉莉酸途径是植物防御咀嚼式昆虫的主要途径，植物受昆虫为害后，其内源茉莉酸水平增加，进而诱导PPO、POD、几丁质酶等防御相关蛋白表达[17]；而水杨酸介导的信号传导途径对植物防御刺吸式昆虫起重要作用，植物受虫害后，体内SA含量增加，激活与植物抗性有关基因的表达[29]。但是赵丽艳研究[30]发现，蚜虫取食小麦既激活了茉莉酸介导的信号传导途径，也激活了水杨酸介导的信号传导途径。本文结果显示，接虫对高钾小麦体内水杨酸含量没有显著影响，而接虫24 h后高钾小麦LOX酶活性显著提高，并且在48 h达到最高，从而使得高钾小麦体内JA含量升高(表1)。PPO和POD是JA诱导的重要防御酶。本文结果表明，接虫48 h后高钾小麦PPO酶活性升高，并于72 h达到最高，而蚜虫为害后高钾小麦体内POD酶活性持续增加，接虫72 h后活性达到最高，两者活性均显著高于未接虫对照和低钾小麦(图2、图4)。这些结果说明，麦长管蚜取食高钾小麦激活了其体内的JA信号传导途径，增强了相关防御酶的表达。此外，高钾小麦在接虫12 h后体内PAL酶上升，在24 h时达到最高(图3)，而PAL酶是类苯丙烷途径的第一个关键酶也是限速酶，它催化苯丙氨酸生成肉桂酸，而肉桂酸即为SA生物合成的原料。因此，并不能断定高钾小麦在受到蚜虫为害时是否也启动了SA信号传导途径。目前也有研究发现，JA和SA之间也存在协同作用[31]。由此，供钾充足的小麦在蚜虫为害后，JA和SA信号传导途径可能分别在不同时间段内起主导作用。
越来越多的研究表明，SA、JA依赖性的防御途径中的元件能够相互影响其它的途径，并且大多数的研究表明JA和SA之间存在拮抗作用。Engelberth等[32]用丙甲菌素处理后的利马豆叶片导致了SA的逐渐积累，而SA的积累却阻碍了13s-氢过氧-亚麻酸(13s-HPLA)向12-氧合植物二烯酸(12-oxx-PDA)的转化，降低了JA的生物合成速度，并最终抑制了所有与JA有关的挥发物的合成。此外，SA及其类似物NIA、BTH也能够抑制JA依赖型的防御基因的表达[30]。Thaler等[34]也认为SA-JA信号传导途径之间存在拮抗串扰。本研究发现，低钾小麦在接虫48 h后体内水杨酸含量显著高于未接虫小麦，而茉莉酸含量却没有显著变化(表1)。但是，低钾小麦体内的LOX酶活性显著高于高钾小麦(图1)。LOX酶是JA合成的关键酶之一。这可能是由于SA含量的增加阻碍了低钾小麦体内JA合成途径中其他重要物质的合成，进而导致LOX酶活性的增加不能提高JA的含量，无法激活低钾小麦体内的JA信号传导途径。此外，也有可能是低钾胁迫显著提高LOX酶活性，导致脂质氧化反应加剧，对低钾植株造成伤害，从而使得蚜虫取食时无法启动体内防御体系。虽然低钾小麦在接种蚜虫48 h后体内SA含量有显著升高，但是与高钾小麦没有显著差异，这可能是低钾小麦受到虫害时的一种应激反应。至于蚜虫取食是否激活了低钾小麦体内的SA信号转导途径，就需要对类丙烷途径的其他关键酶的基因表达或酶活性进行分析。
3.2 钾对蚜虫取食所诱导的防御酶活性的影响作物诱导抗蚜性是作物在受到蚜虫侵害时做出的一种本能反应。研究表明LOX和PPO在植物抵御虫害和病原体侵入中起着非常重要的作用[35, 36, 37]。对棉株的研究发现，PPO的活性与棉花的抗蚜性呈正相关[38]。陈青等[39]研究发现，辣椒受到蚜虫侵害后，叶片中PPO、POD和AsA-POD的活性明显提高，并且酶活性的增强与辣椒抗蚜性显著相关。对小麦和苜蓿的研究发现，蚜虫取食后抗蚜品种的POD和PAL酶活性高于感蚜品种[40, 41]。LOX是植物诱导防御的重要物质，同时也是JA合成的关键酶，JA合成后与膜上的受体相结合而启动防御蛋白或酶的表达，例如PPO、POD和几丁质酶等。PPO主要参与酚类氧化为醌以及木质素前体的聚合作用，醌对昆虫有毒害作用，木质素可促进细胞壁和组织的木质化，提高对病虫害的防御作用；POD不仅参与了木质素的聚合过程，也是细胞内重要的内源活性氧清除剂；而PAL酶催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶[35, 36, 37]。目前关于钾对POD、PPO和PAL等防御酶活性的影响结论不一。鲁剑巍等[42]研究表明钾素缺乏和过量均可导致油菜叶片POD活性上升。段榕琦等[43]］研究发现施钾有利于小麦体内PAL、PPO和POD活性的提高。目前关于钾对LOX酶活性的影响鲜见报道。本研究发现，低钾处理显著提高了小麦叶片中的LOX和POD酶活性(图1，图4)，但是蚜虫取食却没有改变低钾小麦体内这两种酶的活性，并且对PPO和PAL酶活性也没有显著影响(图2，图3)。这表明低钾胁迫使得小麦在受到蚜虫危害时不能有效地激活体内的防御体系，提高防御性酶活性。高钾能够显著提高小麦受到虫害后48 h叶片中的LOX酶活性，利于JA的合成，促进其他防御蛋白的合成。高钾小麦PAL、PPO和POD酶活性在蚜虫为害后不同时期内显著提高，并且高于缺钾植株。这些结果说明高钾能够提高小麦虫害后LOX、PPO、PAL和POD等防御酶活性，从而利于酚类和醌类物质的合成，提高植株的抗虫性。而低钾小麦的四种防御酶活性在整个虫害调查时期均没有显著变化，说明缺钾条件抑制了小麦受到蚜虫为害后防御性蛋白的合成，从而降低其抗虫性。
总之，本研究表明充足供钾能够显著提高小麦受到蚜虫为害后体内茉莉酸含量，激活JA信号传导途径，提高防御蛋白的活性，从而增强小麦对蚜虫的诱导抗性。至于是否启动了SA信号传导途径，需要进行深入分析加以明确。
致谢：河南农业大学闫凤鸣教授对本文写作给予帮助，农业资源与环境专业2008级郭腾飞、李仟同学完成部分工作，特此致谢。
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